0512-86860966
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摘要
大腸桿菌群(coliform)多存在於溫血?jiǎng)游镏S便、人類活動(dòng)之場(chǎng)所及有糞便污染的地方，常被作為食品 被糞便汙染之指標(biāo)。近年來(lái)，ISO 機(jī)構(gòu)提出以腸桿菌科傾注平板檢驗(yàn)方法取代大部分食品的大腸桿菌群MPN 法作為衛(wèi)生指標(biāo)菌，而臺(tái)灣衛(wèi)福部食品藥物管理署亦於 2018 年 8 月公告腸桿菌科檢驗(yàn)方法之草案。 為了評(píng)估新公告之草案與其它兩種大腸桿菌群檢驗(yàn)方法(臺(tái)灣之大腸桿菌群 MPN 法及中國(guó)大陸國(guó)標(biāo)大腸 桿菌群直接平板法)之效能，本研究利用 15 件手搖飲料檢體及 2 件標(biāo)準(zhǔn)菌種的對(duì)照組進(jìn)行三種方法檢驗(yàn)結(jié) 果的比較。利用不同稀釋濃度的檢液及培養(yǎng)基等進(jìn)行評(píng)估，培養(yǎng) 24 小時(shí)後，計(jì)數(shù)及接續(xù)進(jìn)一步鑑定。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)其中有5個(gè)檢體為未檢出和2件陽(yáng)性飲料檢體MPN法超過(guò)1,100 MPN/g，因此，不能作為比較之用， 本研究以介於未檢出及大量檢出中間的 8 件陽(yáng)性檢體進(jìn)行生長(zhǎng)的菌數(shù)多寡比較，結(jié)果指出以新公告腸桿菌 科草案所獲得的腸桿菌科菌數(shù)比其它兩種大腸桿菌群方法所獲得的菌數(shù)高，此說(shuō)明衛(wèi)福部新公告方法作為 衛(wèi)生指標(biāo)菌有其意義及重要性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)市售手搖飲料大腸桿菌群或腸桿菌科衛(wèi)生指標(biāo)菌檢測(cè)不 合格率高達(dá)66.7% (10/15)，值得衛(wèi)生主管單位作為稽核及加強(qiáng)從業(yè)人員衛(wèi)生教育的參考。
關(guān)鍵字:腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、大腸桿菌群、MPN 法、衛(wèi)生指標(biāo)菌
前言
腸桿菌科(Enterobacteriaceae)是指在適 當(dāng)條件下發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸、氧化酶陰性的需 氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。細(xì)菌 學(xué)上將腸桿菌科的細(xì)菌分為 20 個(gè)菌屬，包括Escherichia(埃希氏菌)、Shigella(志賀氏 菌)、Salmonella(沙門氏菌)、Citrobacter(檸檬酸桿菌)、Klebsiella(克雷伯氏菌)、Enterobacter(腸桿菌)、Serratia(沙雷氏
菌)、Hafnia(哈夫尼氏菌)、Edwardsiella(愛(ài)德華氏菌)、Providencia(普羅威登斯 氏菌)、Proteus(變形桿菌)、Morganella(摩根氏菌)、Yersinia(耶爾森氏菌)等[1]。
大腸桿菌群(coliform)並非指特定菌株， 而是指一群在人體腸胃道內(nèi)有相同生理活性 的菌群。在細(xì)菌學(xué)上的意義為一群好氧或兼 性厭氧且能在 37°C下分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革 蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，主要包括檸檬酸桿菌(Citrobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、腸 桿菌(Enterobacter)、大腸桿菌(Escherichiacoli);但不包括非乳糖發(fā)酵型的食品病原菌 (例如:沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌 等)，因此不夠明確表示出食品加工後的衛(wèi) 生狀況[1]。
長(zhǎng)久以來(lái)，食品衛(wèi)生中以指標(biāo)菌作為食 品安全及品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)無(wú)法檢測(cè)食品中每 種有害微生物時(shí)，只針對(duì)某些特定指標(biāo)菌作 為是否合乎衛(wèi)生要求之指標(biāo)，如:總生菌數(shù)、 大腸桿菌群、大腸桿菌。目前臺(tái)灣檢驗(yàn)大腸 桿菌群使用的 MPN 法只是估計(jì)值，並不是很 精確，且大腸桿菌群只能檢測(cè)乳糖發(fā)酵型食 品病原菌。
2018 年 8 月衛(wèi)福部提出腸桿菌科的檢驗(yàn) 方法草案，因?yàn)槟c桿菌科包括所有能夠發(fā)酵 葡萄糖產(chǎn)酸、氧化酶陰性的革蘭氏陰性無(wú)芽 孢桿菌，涵蓋的種類較大腸桿菌群為多，也 包括了病原菌，除了大腸桿菌群的乳糖發(fā)酵 型細(xì)菌，還包含許多非乳糖發(fā)酵型細(xì)菌(如 變形桿菌及其它相近菌種)，能夠確切呈現(xiàn) 較實(shí)際的汙染程度[1]。
本研究主要目的是將臺(tái)灣腸桿菌科直接 平板檢驗(yàn)方法草案與大腸桿菌群 MPN 法、大 陸國(guó)標(biāo)大腸桿菌群直接平板檢驗(yàn)方法做比較， 想瞭解市售飲料中大腸桿菌群及腸桿菌科的 偵測(cè)以不同方法及培養(yǎng)基進(jìn)行，產(chǎn)生之?dāng)?shù)據(jù) 會(huì)有何差異。
材料及方法
試驗(yàn)材料
本研究主要是初步評(píng)估 2018 年 8 月 1 號(hào)衛(wèi) 生局福利部食品藥物管理署訂定之腸桿菌科 檢驗(yàn)方法草案與原先公告的大腸桿菌群 MPN法、大陸國(guó)標(biāo)大腸桿菌群檢驗(yàn)方法這三者的 效能差異，共檢測(cè) 15 件檢體，均為手搖飲料。
試劑與耗材
根據(jù)臺(tái)灣公告大腸桿菌群 MPN 法、腸桿菌科直接平板檢驗(yàn)、大陸國(guó)標(biāo)大腸桿菌群直 接平板檢驗(yàn)所需的稀釋液(磷酸緩衝溶液、 緩衝蛋白腖水)、選擇性增菌液(Lauryl sulfate tryptose broth、brilliant green lactose bile broth)、選擇性分離培養(yǎng)基(VRBGA、VRBA)及滋養(yǎng)培養(yǎng)基(Blood agar plate，BAP)皆購(gòu) 自啟新生物科技有限公司(新北市，臺(tái)灣)。 培養(yǎng)基均經(jīng)無(wú)菌性試驗(yàn)與培養(yǎng)基效能(即滋 養(yǎng)性、增菌性、選擇性與區(qū)分性相關(guān)效能) 試驗(yàn)確認(rèn)品質(zhì)。
菌株製備
本研究的品管對(duì)照菌株為 Enterobacter cloacae ATCC 13047 及 Escherichia coliATCC 25922 作為培養(yǎng)基效能測(cè)試的對(duì)照組 菌種，將兩菌株接種至 BAP 培養(yǎng)於 35±1°C 一般培養(yǎng)箱中 18~24 小時(shí)，之後接種第二次 達(dá)到生化/生理特性的活化效果。
菌液製備
將欲得到預(yù)估菌量的菌液滴至無(wú)菌培養(yǎng) 皿進(jìn)行傾注平板法作為基準(zhǔn)，首先以接種環(huán) 挑取活化後之菌株於 0.85%之 5 mL TSB 中 調(diào)整菌液濃度至相當(dāng) McFarland no. 0.5 標(biāo)準(zhǔn) 液，以分光光度計(jì)測(cè)量 Enterobacter cloacae及 Escherichia coli 之 OD 值分別為 0.082 及0.088，再?gòu)木菏褂梦苋?nbsp;1 mL 菌液加入9 mL 滅菌飲料進(jìn)行序列稀釋至 106 倍，隨後 進(jìn)行效能比較試驗(yàn)。
臺(tái)灣公告之大腸桿菌群 MPN 法[2]:此方 法是檢體經(jīng)序列稀釋後，以三階三管進(jìn)行培 養(yǎng)，並進(jìn)行 MPN 計(jì)數(shù)。操作時(shí)，秤取 50 g飲料檢體加入 450 mL 磷酸緩衝溶液(Phosphate buffer，pH 7.2)，即為 10 倍稀釋液。再以 90 mL 磷酸緩衝溶液進(jìn)行 10 倍序列稀釋後，分 別吸取 1 mL 稀釋液(1:10，1:100 及 1:1,000)注入裝有發(fā)酵管的 Lauryl sulfate tryptose broth (LST)各三支，在 35°C一般培養(yǎng)箱培養(yǎng)24~48 小時(shí)後，若發(fā)酵管內(nèi)有氣體產(chǎn)生則為 大腸桿菌群推定陽(yáng)性。自陽(yáng)性試管內(nèi)取一接 種環(huán)液體至 brilliant green lactose bile broth (BGLB)，在 35°C一般培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24~48 小 時(shí)後，產(chǎn)氣者為大腸桿菌群陽(yáng)性，計(jì)算 BGLB陽(yáng)性反應(yīng)試管數(shù)，查 MPN 表，最後計(jì)算大腸 桿菌群之最確數(shù)，以 MPN/g 表示。
臺(tái)灣公告腸桿菌科直接平板檢驗(yàn)法[3]: 檢體經(jīng)系列稀釋後，以傾注選擇性平板培養(yǎng) 基培養(yǎng)及計(jì)數(shù)之方法。秤取 50 g 飲料檢體加 入 450 mL 緩衝蛋白腖水(BPW)，即為 10 倍 稀釋液。再以 90 mL 緩衝蛋白腖水進(jìn)行 10 倍 序列稀釋後。取 1 mL 稀釋檢液至無(wú)菌培養(yǎng) 皿，二重複，再倒入 10~15 mL 的 violet red bile glucose agar (VRBGA)，以 8 字方式搖 勻，將培養(yǎng)基與檢液充分混勻，待培養(yǎng)基凝 固後，再加 3~4 mL VRBGA 覆蓋平板表層， 防止蔓延生長(zhǎng)並使菌落特徵更為明顯。然後 將凝固後的平板置於 37°C一般培養(yǎng)箱，倒置 培養(yǎng) 24±2 小時(shí)後，計(jì)數(shù)平板上菌數(shù)量(計(jì)數(shù) 介於 15~150 菌落數(shù))。典型菌落為有或無(wú)沉 澱環(huán)的粉紅色至紅色或紫色菌落。從 VRBGA平板上至少挑取 5 個(gè)(少於 5 個(gè)全選)典型 菌落進(jìn)行確認(rèn)。其方式為分別將所挑選的每 一個(gè)菌落，四區(qū)劃線於 BAP，置於 37°C一般 培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng) 24±2 小時(shí)後，挑取單一菌 落進(jìn)行 MALDI-TOF MS 的鑑定。
大陸國(guó)標(biāo)大腸桿菌群直接平板檢驗(yàn)法[4]: 檢體經(jīng)系列稀釋後，以傾注選擇性平板培養(yǎng) 基培養(yǎng)及計(jì)數(shù)之方法。取 50 g 飲料檢體，其 無(wú)菌稀釋液及稀釋方法與臺(tái)灣 MPN 法相同。 取 1 mL 稀釋檢液至無(wú)菌培養(yǎng)皿，二重複， 再 倒 入 15~20 mL 的 violet red bile agar (VRBA)，8 字搖勻，將培養(yǎng)基與檢液充分混 勻，待培養(yǎng)基凝固後，再加 3~4 mL VRBA覆蓋平板表層。然後將凝固後的平板置於36±1°C一般培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng) 18~24 小時(shí) 後，計(jì)數(shù)平板上菌數(shù)量(計(jì)數(shù)介於 15~150 菌落數(shù))。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅 色膽鹽沉澱環(huán)，菌落直徑為 0.5 mm 或更大。 從 VRBA 平板上挑取 10 個(gè)不同類型的典型 和可疑菌落，少於 10 個(gè)菌落時(shí)，則挑取全部 典型和可疑菌落。分別移種於 BGLB，在36±1°C的一般培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24~48 小時(shí)後，產(chǎn) 氣者為大腸桿菌群陽(yáng)性。
MALDI-TOF MS 鑑定腸桿菌科[5]
plate)的一個(gè)凹槽滴加 Bruker 細(xì)菌測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)(bacterial test standard)， 風(fēng) 乾 後 即 可 進(jìn) 行Microflex LT 儀器校正，然後分別以滅菌牙 籤挑取適量的預(yù)檢測(cè)菌落到 MSP 96 靶板的 各個(gè)測(cè)試凹槽上，待乾燥，將測(cè)試凹槽以 1
L 的 70% formic acid(甲酸)(Sigma, USA)覆蓋後，乾燥，最後滴加 1
L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液
結(jié)果
檢測(cè) 15 件飲料檢體及兩組對(duì)照組進(jìn)行臺(tái) 灣公告大腸桿菌群 MPN 法、腸桿菌科直接平 板檢驗(yàn)方法與大陸國(guó)標(biāo)大腸桿菌群直接平板 檢驗(yàn)方法後，若呈陽(yáng)性，則取 15-150 CFU 計(jì) 數(shù)範(fàn)圍內(nèi)之培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖 1)，並分 別取 5 個(gè)或 10 個(gè)可疑菌落進(jìn)行純化，再進(jìn)行MALDI-TOF MS確證，最後代入公式計(jì)算。15 件檢體中扣除三種方法均未檢出的 5件檢體以及 2 件 MPN 法超過(guò) 1,100 MPN/g,因此，不能作為比較之用，本研究以介於未 檢出及大量檢出中間的 8 件陽(yáng)性檢體進(jìn)行 3種方法測(cè)試結(jié)果的比較，結(jié)果如表 1。又本 研究另外發(fā)現(xiàn)手搖飲料以三種方法檢驗(yàn)之衛(wèi)
生不合格率均高達(dá) 66.7%(10/15)
討論
檢體的成分不同，可能會(huì)影響方法之效 能，因此需要額外做一組對(duì)照組。標(biāo)準(zhǔn)菌株 之預(yù)估菌量為 1.5×108 CFU/mL，在三種方 法下檢測(cè)到的菌量皆約為 107 CFU/mL，由 此可看出無(wú)明顯差異，而 MPN 法中無(wú)法得到 準(zhǔn)確菌數(shù)。本研究所使用的檢體 11~15 皆無(wú) 陽(yáng)性產(chǎn)氣管及菌落生長(zhǎng)，因此取無(wú)菌之飲料後作為調(diào)菌基質(zhì)，進(jìn)行對(duì)照組之確認(rèn)。檢體1、檢體 3、檢體 4 及檢體 8 在大陸國(guó)標(biāo)大腸 桿菌群、臺(tái)灣腸桿菌科之方法中菌數(shù)皆落在102 CFU/g，但在 MPN 法只偵測(cè)到 43 MPN/g(95%信賴區(qū)間為 9~180 CFU)，由此可看 出 MPN 法檢出的菌數(shù)比其他兩種方法低。另 外，檢體 2、檢體 5、檢體 6 及檢體 7 之檢出 菌數(shù)以臺(tái)灣腸桿菌科方法最高，其次為大陸 國(guó)標(biāo)大腸桿菌群，而以 MPN 法最低。
臺(tái)灣腸桿菌科檢驗(yàn)方法偵測(cè)之菌數(shù)最多， 是因腸桿菌科包含 42 個(gè)菌屬，涵蓋範(fàn)圍大， 其中就包含衛(wèi)生指標(biāo)菌及常見(jiàn)病原菌，例如 大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、阪崎腸桿 菌等。此方法中所使用的 VRBGA(結(jié)晶紫 中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂)組成分中含有乳糖 和葡萄糖，因此，VRBGA 適用於所有腸桿 菌科菌種的分離。大陸大腸桿菌群檢驗(yàn)方法 所使用的 VRBA(結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂) 與 VRBGA 之組成分有些微差異，VRBA 僅 含有乳糖，適用於乳糖發(fā)酵型細(xì)菌的分離。 因此此方法能偵測(cè)到之菌數(shù)會(huì)比腸桿菌科還 要少。
最後，MPN 法屬於半定量法，透過(guò)大腸 桿菌群之生理功能判斷此菌的存在及數(shù)量， 判讀後，查 MPN 表，推算出來(lái)的數(shù)據(jù)僅為統(tǒng) 計(jì)估計(jì)值，有其信賴區(qū)間，但無(wú)法得到準(zhǔn)確 之?dāng)?shù)據(jù)。若要以 MPN 法與直接平板法做比 較，以直接平板法所獲得的菌數(shù)較高，且在24 小時(shí)內(nèi)可獲得結(jié)果。
根據(jù) MALDI-TOF MS 確證之結(jié)果，發(fā) 現(xiàn)VRBA中可生長(zhǎng)之菌種包含Rahnella aqua- tilis、Pantoea agglomerans、Enterobacter asburiae、Klebsiella oxytoca、Klebsiella pneumoniae、Serratia plymuthica、Erwinia persicina、Ewingella americana、Bacillus clausii，其中 Bacillus clausii 屬於芽孢桿菌 科，主要是因?yàn)槠淇衫萌樘前l(fā)酵產(chǎn)生乳酸， 因此可在 VRBA 生長(zhǎng)。而 VRBGA 除了上述 菌種以外，還鑑定出葡萄糖非發(fā)酵菌中的Achromobacter xylosoxidans，此可能是因?yàn)?此菌可氧化利用葡萄糖之故。由此可知，VRBA 及 VRBGA 除了大腸桿菌群及腸桿菌 科可生長(zhǎng)外，也可能會(huì)有其他菌種生長(zhǎng)。
中國(guó)國(guó)標(biāo)中腸桿菌科檢驗(yàn)方法可分成MPN 法及傾注平板法，ISO 另外公告食品之 腸桿菌科檢驗(yàn)法以直接平板法取代 MPN 法 後，許多國(guó)家隨後跟進(jìn)訂定相關(guān)公告方法，臺(tái)灣於 2018 年 8 月也提出草案。各國(guó)皆以直 接平板法為主要之食品衛(wèi)生指標(biāo)菌，但可能 是因?yàn)?nbsp;MPN 法過(guò)程繁瑣，從採(cǎi)樣至最終報(bào)告 所需時(shí)間較長(zhǎng)，因此臺(tái)灣之腸桿菌科檢驗(yàn)方 法僅公告直接平板法，而沒(méi)有 MPN 法。
本研究發(fā)現(xiàn)手搖飲料以三種衛(wèi)生指標(biāo)菌 檢測(cè)方法檢驗(yàn)的結(jié)果，衛(wèi)生不合格率高達(dá)66.7%(10/15)，然而，其中 60%(6/10) 的大腸桿菌群菌數(shù)低於 100 MPN/g(mL)，若 以 Petrifilm E. coli/coliform count plate 檢 測(cè)，將僅能檢測(cè) 22.7%[6]。
綜合上述結(jié)果，15 件檢體中以臺(tái)灣衛(wèi)福 部公告腸桿菌科的直接平板法效能最佳(獲 得菌數(shù)最高)，因?yàn)榕囵B(yǎng)基之成分可供較多 革蘭氏陰性菌、葡萄糖發(fā)酵型細(xì)菌生長(zhǎng)，而 大陸國(guó)標(biāo)大腸桿菌群之直接平板法所使用的 培養(yǎng)基成分僅限於乳糖發(fā)酵菌的生長(zhǎng)，因此 生長(zhǎng)的菌種較少，最後 MPN 法若是大腸桿菌 群菌量過(guò)多的情況下，將無(wú)法準(zhǔn)確得知其菌 量。
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選取 MSP 96 凹槽靶板(96-wells target
L saturated
- cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix溶液〔配製方法為取 0.0025 g 的 -cyano-4- hydroxycinnamic (Sigma, USA)，加至 250
內(nèi)含 50% acetonitrile (J. T. Baker, USA)，47.5%純水及 2.5% trifluoracetic acid] (Sigma, USA)，配製及保存時(shí)需避光〕 覆蓋，乾燥後，便可置入 MALDI-TOF MS的儀器中開(kāi)始偵測(cè)。產(chǎn)生質(zhì)譜菌屬及菌種個(gè) 別專一性高峰(peaks)能提供獨(dú)一無(wú)二型式圖 譜(profile)，質(zhì)譜分析是一種測(cè)量離子荷質(zhì) 比(電荷-質(zhì)量比)的分析方法，電腦的軟體(software)將產(chǎn)生的質(zhì)譜與軟體中參考質(zhì)譜的 資料庫(kù)相比較，得到關(guān)係最近微生物的名單， 依分?jǐn)?shù)(score)大小排序(numeric rankings)。MALDI-TOF MS 檢驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)樣品會(huì)提 供 10 個(gè)高分鑑定結(jié)果，鑑定結(jié)果第一名分?jǐn)?shù) 大於 2.0，且第一名等於第二名，則鑑定可信 程度至「菌種」。鑑定出的分?jǐn)?shù)小於 2.0，但 高於 1.7，則鑑定可信程度至「菌屬」，以此 標(biāo)準(zhǔn)分析鑑定結(jié)果。
