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摘要 衛(wèi)福部食藥署公告之食品微生物單核球增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)檢驗(yàn)的方法中，建議 先將檢體增菌後，再接種於選擇性培養(yǎng)基（如MOX或PALCAM agar），然後將生長(zhǎng)的疑似菌落移種至血 平板(blood agar plate, BAP)上進(jìn)行 -溶血試驗(yàn)；而於臨床檢驗(yàn)中，則直接將檢體接種至血平板上。兩種檢 驗(yàn)專(zhuān)業(yè)均以生長(zhǎng)菌之溶血現(xiàn)象做為初步鑑別的依據(jù)，然而，李斯特菌在BAP培養(yǎng)後之第一天的生長(zhǎng)菌落甚 小，且溶血現(xiàn)象通常微弱而不明顯，操作者不易觀察，而易導(dǎo)致漏檢。有鑑於此，為了提升李斯特菌生長(zhǎng) 菌落的溶血效果，本研究以李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC 19111)接種至添加溶血加強(qiáng)劑（啟新公司提供）之各 種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的血平板上，基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分分別為T(mén)rypticase soy agar（胰化酪蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基，TSAII）、Columbia agar（哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基)、Brucella agar（布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基）與Brain heart infusion agar（腦心浸出物瓊脂培養(yǎng)基，BHIA）。接種後的各種血平板於35±1℃培養(yǎng)，分別於24及 48小時(shí)觀察菌 落特徵，以探討溶血加強(qiáng)劑對(duì)其生長(zhǎng)促進(jìn)效能以及對(duì)菌落溶血圈直徑大小的影響，結(jié)果指出，含有溶血加 強(qiáng)劑之各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基配製成的血平板上，李斯特菌生長(zhǎng)能力正常，所有菌落的溶血圈環(huán)比未添加之對(duì)照 組皆有增大情形，而顯現(xiàn)更易觀察，並可縮短的判讀時(shí)間 (24 h)，在食品或臨床檢驗(yàn)上，添加溶血加強(qiáng)劑 之血平板可降低李斯特菌之漏檢或判讀錯(cuò)誤的情況發(fā)生，值得檢驗(yàn)人員善加利用。
關(guān)鍵字：?jiǎn)魏饲蛟龆嘈岳钏固鼐?、溶血加?qiáng)劑、 -溶血、血平板培養(yǎng)基
前言
單核球增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下簡(jiǎn)稱(chēng)李斯特菌），此菌於 3-45℃溫度範(fàn)圍內(nèi)可增菌[1]，而最適生長(zhǎng)溫 度為30-37℃，且可於血平板培養(yǎng)基上呈現(xiàn) -溶血(beta-hemolysis，菌落周?chē)释耆苎? 之生化特性[2]。普遍存於水、泥土等周遭環(huán) 境，亦存在於加熱未完全或受污染之蔬菜、肉品及乳制品，其引起的感染癥為李斯特菌 癥(Listeriosis)，主要以食品作為傳染途徑之 媒介，患者通常會(huì)發(fā)生發(fā)燒、頭痛或腸胃不 適等癥狀，如噁心、嘔吐及腹瀉等現(xiàn)象，也 可能引發(fā)嚴(yán)重併發(fā)癥，例如：腦膜炎或敗血 癥，孕婦、嬰兒、年長(zhǎng)者、或免疫力較弱的 人受感染的風(fēng)險(xiǎn)較高[3]。且李斯特菌癥已於 2018年 1 月 1 日被衛(wèi)生福利部疾病管制署列 為「?jìng)魅静》乐畏ā挂?guī)定之第四類(lèi)傳染病[4]。 根據(jù)吾等統(tǒng)計(jì)2018年 1-8月引發(fā)全球主要食 安事件的病原菌，依食安事件數(shù)的比例顯示 李斯特菌僅略少於沙門(mén)氏菌，位居第二（表 1）[5-6]，由此可見(jiàn)其對(duì)於食品安全之重要性
由於李斯特菌在平板上生長(zhǎng)之菌落直徑 較小、溶血圈較不明顯而不易觀察。根據(jù)衛(wèi) 生福利部食品藥物管理署公告之檢驗(yàn)方法， 李斯特菌初步鑑定之 -溶血試驗(yàn) ( -hemolysis test) 為將食品檢體先接種至選擇性培養(yǎng)基 如：MOX（改良式牛津培養(yǎng)基，Modified Oxford medium）、PALCAM（帕爾康李斯 特菌選擇性培養(yǎng)基，PALCAM Listeria Selective agar）或顯色性培養(yǎng)基 (CHROMagar) 後， 再將懷疑為李斯特菌之菌落移種至含綿羊血 之血平板並培養(yǎng)48小時(shí)，然而，一般李斯特 菌菌落將呈微弱溶血現(xiàn)象[7]，而降低其判讀 結(jié)果的準(zhǔn)確性，將影響李斯特菌從食品中分 離的陽(yáng)性率[8]；另外，於臨床檢體的李斯特 氏菌檢驗(yàn)中，將檢體（如腦脊髓液、產(chǎn)道分 泌物等）直接接種至血平板上，根據(jù)菌落的 溶血現(xiàn)象，再進(jìn)一步純化及鑑定，若溶血現(xiàn) 象不明顯，將使操作者觀察困難，而導(dǎo)致漏 檢。 衛(wèi)福部公告之食品微生物檢驗(yàn)方法[7]與 中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[9]，對(duì)於李斯特菌 的溶血試驗(yàn)皆建議接種懷疑菌落至以TSA-II （胰蛋白酶大豆瓊脂培養(yǎng)基，Trypticase soy agar-II）配製含5% 綿羊血的血平板，培養(yǎng) 48小時(shí)，再以判讀溶血情形；而臨床李斯特 菌檢驗(yàn)中，多使用以含 TSA-II 或 Columbia agar（哥倫比亞瓊脂）基礎(chǔ)培養(yǎng)基所配製的 血平板。 為了促進(jìn)李斯特菌之 -溶血情形於血液 平板上更加明顯，本研究以TSA-II、Columbia agar、Brucella agar（布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基） 及 BHIA（腦心浸出物瓊脂培養(yǎng)基，Brain heart infusion agar）作為不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基之 血平板並添加溶血加強(qiáng)劑（Hemolysis enhancer，啟新生技公司研發(fā)與提供），接種測(cè) 試的李斯特菌於上述幾種血平板中，培養(yǎng)後 進(jìn)行李斯特菌之溶血環(huán)大小及判讀清晰度比 較。研究中所使用之溶血加強(qiáng)劑曾應(yīng)用於CMPTM / GBS detection agar（啟新生物科 技有限公司，臺(tái)灣）中，可誘導(dǎo)B 群鏈球菌 （GBS，乙型鏈球菌，Streptococcusagalatiae） 的 -溶血型變成為 -溶血型，而不影響其他 測(cè)試菌的溶血型式及菌落之外觀，該研究同 時(shí)指出溶血加強(qiáng)劑並不會(huì)改變李斯特菌之溶 血形態(tài)，使其仍維持 -溶血型[10]。有鑒於此， 本研究結(jié)果將觀察含溶血加強(qiáng)劑的血平板對(duì) 李斯特菌菌落之 -溶血環(huán)大小的影響。
表 1. 2018年 1-8月引發(fā)全球主要食安事件 的病原菌統(tǒng)計(jì)
污染菌名稱(chēng) 食安事件數(shù) 比例 沙門(mén)氏菌 48 37.5% 李斯特菌 39 30.5% 產(chǎn)毒性大腸桿菌 24 18.8% 肉毒桿菌 7 5.5% 阪崎腸桿菌 1 0.8% 仙人掌桿菌 1 0.8% A 型肝炎 3 2.3% 諾羅病毒 2 1.6% 未指出菌名 3 2.3% 總數(shù) 128 100%
材料方法
菌株製備 本研究使用Listeria monocytogenes ATCC 19111 作為培養(yǎng)基效能評(píng)估的菌株，此菌保 存於-70℃冷凍庫(kù)，測(cè)試前移種至 BAP （血 平板，blood agar plate，啟新生物科技有限 公司，新北市），培養(yǎng)於35±1℃ CO2培養(yǎng)箱 中 22~24小時(shí)後，再接種至另一BAP進(jìn)行第 二次活化。
菌液之製備 欲取得適當(dāng)菌量之李斯特菌菌液以塗抹 於培養(yǎng)基上，故先以接種環(huán)鈎取BAP上已活 化之李斯特菌菌落至5 mL TSBYE（胰化酪
蛋白大豆酵母抽出物培養(yǎng)液，Trypticase soy broth with 0.6% yeast extract）中，調(diào)菌液 至相當(dāng)於McFarland No. 0.5的標(biāo)準(zhǔn)濃度（約 1.5×108 CFU/mL），利用分光光度計(jì)測(cè)其 O.D.值為0.089，再使用微量吸管吸取0.5 mL 此菌液加入至4.5 mL TSBYE中作十倍稀釋?zhuān)?序列稀釋五次後，採(cǎi)用最後一管稀釋液進(jìn)行 各個(gè)培養(yǎng)基的效能評(píng)估。
培養(yǎng)基 效能評(píng)估使用的不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括： (i) TSA-II、(ii) Columbia agar、(iii) Brucella agar 及 (iv) BHIA，有關(guān)其等之組成分列於 表 2；以此四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基（均購(gòu)自 BD 公司）配製成含5% 綿羊血之BAP（由啟新生 技公司配製）作為對(duì)照組，另外將上述各種 BAP額外添加相同濃度之溶血加強(qiáng)劑（啟新 生技公司提供）作為試驗(yàn)組。
培養(yǎng)基之生長(zhǎng)及 -溶血效能評(píng)估 操作步驟：將上述製備完成之菌液，以 微量吸管分別吸取0.05、0.1、0.15與 0.2mL 至各個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組之血平板中，再使用 無(wú)菌三角玻棒均勻塗抹平板表面，此實(shí)驗(yàn)重 複操作二次，每次接種的血平板為兩個(gè)，接 著將所有平板倒置，培養(yǎng)於35±1℃培養(yǎng)箱中 24~48小時(shí)後，觀察各個(gè)培養(yǎng)基上的菌落生 長(zhǎng)情形，並且量測(cè)菌落之溶血圈直徑(mm)，最終選擇50~250 CFU 菌量培養(yǎng)基之平板進(jìn) 行計(jì)數(shù)。
溶血圈大小量測(cè)：利用帶表卡尺（太一 電子檢測(cè)有限公司，新北市）量測(cè)經(jīng)培養(yǎng)24 及 48小時(shí)後之各個(gè)平板上的菌落溶血圈直 徑，判讀時(shí)將培養(yǎng)皿底部正對(duì)光源，隨機(jī)採(cǎi) 取10個(gè)獨(dú)立分離菌落，觀察量測(cè)透明之溶血 圈直徑大小並取得平均值(mm)，最後再進(jìn)行 比較試驗(yàn)組與對(duì)照組之差異。比較方式為將 試驗(yàn)組中以TSA-II為基礎(chǔ)培養(yǎng)基所配製的血 平板上菌落溶血環(huán)之大小作為基準(zhǔn)(100%) 進(jìn) 行計(jì)算，公式為：（含有各種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的 血平板上菌落溶血圈之直徑平均值/ 含 TSAII 基礎(chǔ)培養(yǎng)基之試驗(yàn)組血平板上菌落溶血圈 之直徑平均值）×100%。
結(jié)果 單核球增多性李斯特菌在含有溶血加強(qiáng) 劑之TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 及 BHIA 基礎(chǔ)培養(yǎng)基所配製成的試驗(yàn)組血平 板與未添加溶血加強(qiáng)劑的對(duì)照組血平板上， 分別接種濃度約1.5×103 CFU/mL李斯特菌 菌液，分別取0.05、0.1、0.15及 0.2 mL 的 量至各個(gè)試驗(yàn)組與對(duì)照組之血平板培養(yǎng)基中 進(jìn)行塗抹法，此實(shí)驗(yàn)重複操作二次，每次接 種的血平板為兩個(gè)，經(jīng)35±1℃培養(yǎng)24~48小 時(shí)後，以獲得菌數(shù)落在50~250 CFU 範(fàn)圍之 平板進(jìn)行計(jì)數(shù)及量測(cè)溶血圈大小，結(jié)果紀(jì)錄 於表3。添加於未添加溶血加強(qiáng)劑血平板的 菌落數(shù)均落在30%以?xún)?nèi)，顯示細(xì)菌之生長(zhǎng)效 能均為相同。 各個(gè)血平板上之李斯特菌菌落溶血圈的 直徑大小列於表4，比較含各基礎(chǔ)培養(yǎng)基之 血平板上的菌落之形狀與顏色，試驗(yàn)組與對(duì) 照組並無(wú)明顯差異，當(dāng)培養(yǎng)24小時(shí)後的菌落 顯示為小型、邊緣完整、透明凸面且呈小圓 形，當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)至48小時(shí)，菌落增大且變得 不透明，顏色呈灰白色。含有溶血加強(qiáng)劑的試驗(yàn)組血平板中，與 未添加溶血加強(qiáng)劑之對(duì)照組血平板相比，不 論觀察時(shí)間為24或 48小時(shí)，試驗(yàn)組的菌落 生長(zhǎng)比對(duì)照組的溶血圈更擴(kuò)散。（圖1）在 培養(yǎng)24小時(shí)後，含有溶血加強(qiáng)劑之試驗(yàn)組血 平板菌落顯示明顯的溶血圈，而在培養(yǎng)48小 時(shí)後，含有溶血加強(qiáng)劑的試驗(yàn)組血平板上， 菌落的溶血圈直徑皆更增大至約4 mm，甚 為清晰而易於觀察。
討論
本研究使用的四種基礎(chǔ)培養(yǎng)基之試驗(yàn)組 與對(duì)照組血平板上，各接種適當(dāng)濃度之菌液 0.05、0.1、0.15及 0.2 mL 進(jìn)行塗抹法並操 作兩次，每次接種兩個(gè)血平板後，相同取量 的菌液在各種相同基礎(chǔ)培養(yǎng)基之試驗(yàn)組與對(duì) 照組血平板上所生長(zhǎng)之菌落數(shù)目無(wú)明顯差異 （表3），皆落在合理的誤差範(fàn)圍 (30%) 內(nèi) [13-14]。由此可知，溶血加強(qiáng)劑對(duì)於各種基礎(chǔ) 培養(yǎng)基之血平板並無(wú)抑制或促進(jìn)菌落生長(zhǎng)的 情形。 根據(jù)研究結(jié)果（表4）指出，以TSA-II、 Columbia agar、Brucella agar及 BHIA作為 基礎(chǔ)培養(yǎng)基之血平板，接種適當(dāng)濃度菌液並 培養(yǎng)24小時(shí)後，未添加溶血加強(qiáng)劑的對(duì)照組 血平板上，菌落溶血圈不明顯而不易觀察， 直至培養(yǎng)48小時(shí)後，才可稍微清楚看到溶血 圈；然而，添加溶血加強(qiáng)劑的各基礎(chǔ)培養(yǎng)基 之試驗(yàn)組血平板中，溶血現(xiàn)象明顯，相較於 對(duì)照組，其溶血圈環(huán)皆有增大情形，直徑皆 約為4 mm，就算不正對(duì)光源觀察，肉眼也 清楚可見(jiàn)，可使操作者更方便且正確觀察， 並可於較短的培養(yǎng)時(shí)間(24小時(shí))內(nèi)更清楚明 顯地判讀其溶血情形，有利於操作者觀察李 斯特菌菌落的溶血現(xiàn)象，在食品或臨床檢驗(yàn) 上，可降低漏檢或判讀錯(cuò)誤的情況發(fā)生。 綜合上述結(jié)果，溶血加強(qiáng)劑添加於以 TSA-II、Columbia agar、Brucella agar 及BHIA 作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基之血平板中，均可促 進(jìn)李斯特菌之 -溶血，使得溶血圈直徑增大， 且此溶血加強(qiáng)劑不會(huì)影響(抑制或促進(jìn))平板 上菌落的生長(zhǎng)。因此，溶血加強(qiáng)劑對(duì)於食品 中分離的李斯特菌在血平板上進(jìn)行溶血試驗(yàn) 初步鑑定時(shí)，可更清楚明顯地辨識(shí)溶血情形， 而可協(xié)助鑑別李斯特菌的檢出，並且可縮短 一天的檢驗(yàn)時(shí)間。同樣地，亦可協(xié)助臨床檢體之李斯特菌的分離，值得檢驗(yàn)人員善加利 用。此溶血加強(qiáng)劑在未來(lái)或許也可以應(yīng)用於 協(xié)助鑑定其它各種臨床病原菌如 Propionibacterium acnes、Actinomyces neuii subsp. anitratus、Corynebacterium auris、Corynebacterium bovis、Corynebacterium coylae 及 Corynebacterium glyucuronolyticum[15]， 但須進(jìn)一步評(píng)估。
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