0512-86860966
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1. 問： 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的食品中腸桿菌科之檢驗(yàn)方法（國標(biāo)GB 4789.41-
2016） 是否會取代食品的衛(wèi)生指標(biāo)大腸桿菌群檢驗(yàn)？此方法的優(yōu)點(diǎn)何在？
答：檢視國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會（ICMSF）對各類食品微生物安全和品
質(zhì)檢驗(yàn)的建議，食品衛(wèi)生指標(biāo)菌的檢驗(yàn)幾乎沒有提到大腸菌群，而僅提到腸桿菌科檢驗(yàn)以及大腸桿菌檢驗(yàn)，因此，未來的趨勢，除了水檢體(加工及生產(chǎn)用水以及天然礦泉水)外，腸桿菌科的檢驗(yàn)有可能取代大部分的大腸菌群檢驗(yàn)。進(jìn)行食腸桿菌科檢驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)包括：
(1) 檢測后三天即可發(fā)出最終報(bào)告
(2) 直接平板法的檢驗(yàn)操作簡便，同時(shí)，確認(rèn)試驗(yàn)(葡萄糖 glucose還原試驗(yàn)及氧化酶試驗(yàn))也很容易操作及判讀
(3) 在VRBGA上的生長菌落容易觀察辨認(rèn)
(4) 可同時(shí)檢測大腸菌群及致瀉性病原菌(如沙門氏菌及志賀氏菌)
比單純檢驗(yàn)大腸菌群的范圍廣，更具有衛(wèi)生指標(biāo)性
(5) 可免除繁瑣費(fèi)時(shí)配制含發(fā)酵管的LST及BGLB試管培養(yǎng)基
(6) 所得到的數(shù)據(jù)為真實(shí)的菌落數(shù)，而非大腸菌群的最可能數(shù)（MPN）
2. 問： 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中腸桿菌科之檢驗(yàn)方法（國標(biāo)GB 4789.41-2016）
是否可利用3M Petrifilm? Enterobacteriaceae Count的培養(yǎng)膜代替？
答：不能。國標(biāo)方法為食品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)方法，具有法律地位。Petrifilm
替代方法的使用必須先操作確效試驗(yàn)。更何況腸桿菌科菌數(shù)少于100
CFU時(shí)，3M
Petrifilm? Enterobacteriaceae Count將僅有23%左右能夠測出腸桿菌科，通常食品(飲料)若有腸桿菌科污染，菌數(shù)不會太高(高于100 CFU約占25%)，因此，若使用3M Petrifilm?
Enterobacteriaceae Count替代方法，將會導(dǎo)致錯(cuò)誤的檢驗(yàn)，所謂「錯(cuò)誤的檢驗(yàn)比沒有檢驗(yàn)還糟」，自我感覺良好的檢驗(yàn)，雖然方便，但結(jié)果會誤導(dǎo)該批受檢食品的質(zhì)量，若衛(wèi)生主管單位抽檢，將可能發(fā)生「罰款上報(bào)之商譽(yù)損失」，能不謹(jǐn)慎嗎？ 此外，腸桿菌科在VRBGA的生長菌可用于操作葡萄糖 （glucose）利用試驗(yàn)及氧化酶試驗(yàn)，而Petrifilm則無法進(jìn)行這些確認(rèn)的腸桿菌科特定試驗(yàn)。除了上述外，操作公告的腸桿菌科檢驗(yàn)方法的優(yōu)點(diǎn)可包括，但不限于如下：
(1) 符合國標(biāo)方法，檢測結(jié)果沒有疑慮。
(2) 檢測的樣本量為25 g(mL)，具有代表性，而非僅取1 mL的檢體
檢驗(yàn)之無代表性。
(3) 能夠檢出低菌量的食品中腸桿菌科。
(4) 分離菌可用于保存，供作爾后的確認(rèn)及備查。
(5) 檢驗(yàn)方法符合國際貿(mào)易的要求，因其根據(jù)為ISO 21528分析方
法。
3. 問：我實(shí)驗(yàn)室想根據(jù)國標(biāo)GB 4789.41-2016操作食品中腸桿菌科之檢驗(yàn)法，
請問購買VRBGA粉末自己配制較好呢？還是購買成品瓶裝VRBGA較好？
答：購買粉末或瓶裝VRBGA培養(yǎng)基均可，端視品管人員的人力、實(shí)驗(yàn)室空
間及配制的儀器設(shè)備而定。自配時(shí)，品管人員需有能力及時(shí)間操作
VRBGA的無菌性及生長效能之品管試驗(yàn)。目前許多食品檢驗(yàn)單位制備
培養(yǎng)基均沒有操作品管試驗(yàn)，配制后立即使用，培養(yǎng)基的質(zhì)量堪憂。若
外購必須向有信譽(yù)的成品培養(yǎng)基生產(chǎn)公司(如啟新公司)購買，因?yàn)槠涑?/span>
品培養(yǎng)基均有操作必要的培養(yǎng)基品管試驗(yàn)(采購時(shí)可要求提供品管相
片)，因此，以品管合格的成品瓶裝的VRBGA，經(jīng)煮溶及冷卻到47℃
~50℃后操作檢驗(yàn)將更能讓檢驗(yàn)人員對結(jié)果具有信心、安心及放心。另
外，一瓶150 mL的瓶裝VRBGA剛好適合操作一個(gè)檢體的三階二重復(fù)
測試(共6個(gè)平板)。依衛(wèi)福部公告方法，檢測腸桿菌科，每次需采集5
個(gè)食品檢體，因此每次需使用5瓶的150 mL瓶裝VRBGA。
4. 問：食品中腸桿菌科之檢驗(yàn)方法 （國標(biāo)GB 4789.41-2016）以及其他病原
菌的檢測要求每批食品采檢5個(gè)檢體進(jìn)行檢測，可否將5個(gè)檢體混合
在一起，僅進(jìn)行一次檢驗(yàn)，以節(jié)省時(shí)間？
答：雖然國際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會（ICMSF）提到混合檢體的原則為「必
須先以單一細(xì)菌進(jìn)行足夠時(shí)間增菌后確效，其可測出單個(gè)細(xì)菌生長才能混合檢體」但在國標(biāo)方法的食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法并沒有提到可「依樣畫葫蘆」般地可混合檢體進(jìn)行操作，因此，尚不能混合檢體進(jìn)行檢驗(yàn)。
5. 問：粉末或外購的VRBGA培養(yǎng)基有效期有多長？可煮溶幾次？剩余的
VRBGA可再煮溶使用嗎？
答：(1) 粉末或瓶裝VRBGA之有效期可參閱公司之COA說明書，粉末配
制后或瓶裝VRBGA若保存在2-8℃左右，且避光及包裝良好并未
開啟，約可保存在6個(gè)月左右，但品管人員最好在3個(gè)月內(nèi)使用，也就是說每次配制的量或外購的量不要太多，依照檢體數(shù)目估算使用培養(yǎng)基的使用量即可。
(2) 瓶裝VRBGA僅可煮溶一次，此與生菌數(shù)計(jì)數(shù)的PCA以及霉菌及
酵母菌的DG18或大部份瓶裝培養(yǎng)基相同。煮溶次數(shù)超過1次，將
會破壞養(yǎng)分影響目標(biāo)菌的生長。
(3) 不能，剩余的VRBGA不可再煮溶使用，應(yīng)該丟棄。
6. 問：食品中腸桿菌科檢驗(yàn)方法 (國標(biāo)GB 4789.41-2016) 的分離培養(yǎng)系采用
直接平板法(傾注平板法)，VRBGA凝固后，再次倒入5~10 mL培養(yǎng)基
覆蓋，使成雙層培養(yǎng)基，是為什么？
答：再次倒入5~10 mL培養(yǎng)基覆蓋，使成雙層培養(yǎng)基的目的是創(chuàng)造無氧環(huán)
境，因?yàn)槟c桿菌科菌種為嗜氧菌及兼性厭氧菌，在無氧環(huán)境有時(shí)比在有
氧環(huán)境生長佳，同時(shí)，可防止一些菌屬[如變形桿菌(Proteus)]菌落蔓延，
以及一些黏稠生長菌﹝如克雷伯氏菌(Klebsiella)﹞彼此間的混雜而形
成片狀或團(tuán)塊外觀。
7. 問：假設(shè)一些乳制品及嬰兒食品的腸桿菌科衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)如下表，要如何操作
檢驗(yàn)以節(jié)省人力及物力？
|
編號 |
產(chǎn)品 |
微生物 |
分析方法 |
類型 |
采樣方案和限量/mL |
|||
|
N |
c |
m |
M |
|||||
|
一 |
嬰兒食品類 |
腸桿菌科 |
ISO 21528 |
5 |
10 |
0 |
10 |
|
|
二 |
巴氏滅菌乳 |
腸桿菌科 |
ISO 21528 |
5 |
5 |
2 |
＜1 |
5 |
|
三 |
干乳制品 |
腸桿菌科 |
ISO 21528 |
5 |
5 |
2 |
＜3 |
9.8 |
|
四 |
冰淇淋產(chǎn)品 |
腸桿菌科 |
ISO 21528 |
5 |
5 |
2 |
10 |
102 |
答：上述四類產(chǎn)品中，一號檢體為一般食品中腸桿菌科之衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，二至四
號為ICMSF提出的國際標(biāo)準(zhǔn)。采檢的檢體數(shù)從5~10個(gè)。一號的10個(gè)檢體中，不能有任何菌數(shù)超過10 CFU/mL；二號的5個(gè)檢體中，不能有2個(gè)以上檢體超過1，不能有任何檢體超過5 CFU/mL；三號的5個(gè)檢體中，不能有2個(gè)以上檢體超過3，不能有任何檢體超過9.8 CFU/mL。因此，衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)所容許的腸桿菌科的數(shù)目甚低，如果依照一般檢體的檢驗(yàn)，首先需要以緩沖蛋白胨水(BPW)稀釋10倍，那么此10倍的稀釋液取1 mL操作直接平板法，若長出1個(gè)腸桿菌科菌落則代表10 CFU/mL，因此，一、二及三號檢體不合格；這種情況下，檢驗(yàn)結(jié)果容易發(fā)生偏差，因此，只需選擇原液及10倍稀釋度進(jìn)行雙重復(fù)的傾注平板法，即足以了解檢體是否衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(合格)。至于四號檢體，5個(gè)檢體中，不能有2個(gè)以上檢體超過10，不能有任何檢體超過102 CFU/mL，則需選擇三個(gè)稀釋度(原液、10倍及100倍)進(jìn)行雙重復(fù)的傾注平板法。若檢體為固體，因公告方法建議的檢體量為50 g，可依照檢體的溶解度調(diào)整緩沖蛋白胨水(BPW)的量(如50 mL的雙倍量BPW，100 mL的1.33倍量BPW，150 mL的1.25倍量BPW，200 mL的1.2倍量BPW)，以便稀釋到少于10倍的適當(dāng)倍數(shù)，而仍然能夠溶解檢體。如此操作，才能得到少于10 CFU/g的結(jié)果，結(jié)果將更準(zhǔn)確，也能節(jié)省人力及物力，并且符合衛(wèi)福部公告的腸桿菌科檢驗(yàn)操作流程。因?yàn)闄z測大于100以上CFU/g，才需要選擇操作100倍或1,000倍以上的稀釋液。
8. 問：食品中腸桿菌科之檢驗(yàn)方法 (國標(biāo)GB 4789.41-2016)，若發(fā)現(xiàn)
VRBGA之移種NA平板生長菌菌特性為葡萄糖（ glucose）發(fā)酵正反應(yīng)及氧化酶負(fù)反應(yīng)，我還需要鑒定菌數(shù)或菌種的層次嗎？
答：不必。公告方法只提到腸桿菌科的特性檢測，葡萄糖（glucose）發(fā)酵正
反應(yīng)及氧化酶負(fù)反應(yīng)的特征已經(jīng)足以證明。但如果要了解究竟是何種菌，則可進(jìn)行進(jìn)一步鑒定以作為追蹤污染源的參考，但鑒定結(jié)果不必提出報(bào)告。
9. 問：食品中腸桿菌科之檢驗(yàn)方法（國標(biāo)GB 4789.41-2016），如果檢驗(yàn)室
要得到小于10 CFU/g，第一個(gè)稀釋度是不是將25 mL檢體加到25 mL的雙倍量稀釋液里面？
答：根據(jù)檢體的類型將液體、固體或其他狀態(tài)的檢體分別處理，液態(tài)檢體可
以直接取1 mL原液進(jìn)行傾注平板法(雙重復(fù))，固體則取25 g接入25 mL
雙倍量稀釋液，此為2倍稀釋，接著再進(jìn)行20倍，200倍或以上之稀
釋。稀釋液中的0.1% peptone diluent以及buffer peptone water(BPW)所
含的蛋白胨(peptone)可以讓損傷菌修復(fù)；稀釋液中的磷酸鹽緩沖液
(BPBW)以及磷酸鹽緩沖生理食鹽水具有維持pH的功能，可以讓生長
菌在其最適的酸堿環(huán)境(pH)生長。
10. 問：食品中大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)（國標(biāo)GB 4789.38-2012）提到將產(chǎn)氣
的LST broth w/Durham tube取1圈環(huán)量移種之EC broth w/Durham tube，然后培養(yǎng)在44.5℃環(huán)境，但用ATCC的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株接種EC broth w/Durham tube，如果培養(yǎng)溫度跑到45.5℃，常不產(chǎn)氣或產(chǎn)生的EC管數(shù)不如預(yù)期，為何如此？
答：根據(jù)美國FDA出版的細(xì)菌分析手冊(BAM)，大腸桿菌的檢驗(yàn)已經(jīng)將EC broth w/Durham tube的培養(yǎng)溫度從45.5℃± 0.2°C改為44.5°C ±0.2°C (the incubation temperature of EC tubes has been changed from 45.5°C ± 0.2°C to 44.5°C ± 0.2°C)。國標(biāo)方法中有關(guān)食品衛(wèi)生指標(biāo)大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)提到將EC broth的培養(yǎng)溫度為44.5°C ± 0.2°C的水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)時(shí)間為24 ± 2小時(shí)，檢查小管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未有產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 ± 2小時(shí)。顯然地，45.5℃的溫度將影響大腸埃希氏菌的產(chǎn)氣，44.5℃為適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)溫度。
11. 問：操作單核細(xì)胞球增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法（國標(biāo)GB 4789.38-2012）的
CAMP協(xié)同溶血試驗(yàn)時(shí),有沒有出現(xiàn)過單核細(xì)胞球增生李斯特氏菌在馬
紅球菌端有加強(qiáng)溶血的現(xiàn)象？ 我們所用標(biāo)準(zhǔn)菌株（來源為ATCC或CMCC）都發(fā)現(xiàn)在馬紅球菌端有加強(qiáng)溶血現(xiàn)象，因此對標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行各種特性測試如血平板溶血試驗(yàn)、顯色培養(yǎng)基、生化特性及顯微鏡底下的革蘭氏染色特性等都呈現(xiàn)李斯特菌典型特征，只有CAMP試驗(yàn)不符合，請問為何如此？
答：雖然國標(biāo) GB 4789.30-2016公告單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢驗(yàn)方法提到CAMP試驗(yàn)的正反應(yīng)為「與S. aureus相接處具溶血現(xiàn)象，與R. equi相接處則否事實(shí)上，國標(biāo)方法與「食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)」書籍均提到「單核細(xì)胞增生李斯特氏菌與R. equi相接處將有5~8%會有溶血現(xiàn)象」，因此，你的檢驗(yàn)結(jié)果仍然符合單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的特性。另外，操作單核細(xì)胞增生李斯特氏菌CAMP溶血試驗(yàn)時(shí)需要注意：(1)使用正確的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(如ATCC 25923)。(2)標(biāo)準(zhǔn)菌株從庫存冷凍柜取出后要移種2次，以恢復(fù)活性和確認(rèn)純度,否則，如果直接用庫存菌株測試容易出現(xiàn)與結(jié)果不一致的現(xiàn)象。(3)培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間要求為35°C培養(yǎng)24 h~48 h，建議培養(yǎng)24 h后就要開始觀察，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌在靠近S. aureus端的溶血會清楚些(如月亮般的透明環(huán)或箭頭形)，速溶血有加強(qiáng)現(xiàn)象，與周圍S. aureus溶血有所區(qū)別，第一天觀察時(shí)，測試菌與R. equi端常尚無加強(qiáng)溶血現(xiàn)象,但當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間，則與R. equi接近處也有可能出現(xiàn)透明環(huán)，因此，加強(qiáng)溶血試驗(yàn)呈陽性。
12. 問：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)方法提到溶血試驗(yàn)，使用含羊血的血平
板培養(yǎng)基(BAP)，但培養(yǎng)24小時(shí)后，甚至至48小時(shí)仍然很難觀察溶血現(xiàn)象，是否有更好的容易觀察溶血現(xiàn)象的培養(yǎng)基？
答：血平板（BAP）不容易觀察溶血現(xiàn)象，除了可在接種后插種第一劃線處5~7下外，檢驗(yàn)室可以使用啟新公司特別設(shè)計(jì)具有加強(qiáng)溶血特性的李斯特菌偵測血平板（檢驗(yàn)及品保雜志2017；7:171-178）。
13. 問：本廠的最終產(chǎn)品衛(wèi)生指針大腸菌群/大腸埃希氏菌檢驗(yàn)合格，同時(shí)，幾
項(xiàng)病原菌檢測也未發(fā)現(xiàn)病原菌，請問是否代表公司的產(chǎn)品是安全的？
答：如果僅檢驗(yàn)1個(gè)產(chǎn)品，較無代表性，因此，食品的采樣規(guī)劃一般至少采樣5個(gè)產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)，較具代表性。檢驗(yàn)無大腸桿菌群/大腸埃希氏菌雖然較可提供有效的產(chǎn)品安全和穩(wěn)定性信息，但微生物檢驗(yàn)仍有其的局限性（Limitations），檢驗(yàn)并不能保證產(chǎn)品的安全性。這是因?yàn)槲⑸镌谑称分蟹植疾黄骄?，因此?b>受到采樣方案統(tǒng)計(jì)學(xué)上的限制，尤其當(dāng)危害以低濃度不可接受的風(fēng)險(xiǎn)存在，并且流行度（prevalence）較低且易變時(shí)，微生物檢驗(yàn)可能傳達(dá)錯(cuò)誤的安全信息。當(dāng)樣品采檢自一批產(chǎn)品的可接受(合格)部分時(shí)，但檢驗(yàn)可能仍然無法檢測出該批次產(chǎn)品中可能存在的微生物。從農(nóng)場到餐桌，食品安全涉及多種因素包括食品供應(yīng)鏈（如原產(chǎn)地、初級生產(chǎn)、原料、加工過程及加工環(huán)境、包裝及運(yùn)輸、儲存環(huán)境）中適當(dāng)?shù)念A(yù)防性（preventive）、預(yù)先反應(yīng)的（proactive）措施來確證(ensure)，而不是僅透過微生物檢驗(yàn)來達(dá)到。單獨(dú)進(jìn)行最終產(chǎn)品檢驗(yàn)僅針對結(jié)果(consequences)做出反應(yīng)（reactive），而并非問題產(chǎn)生(cause)的原因。又微生物的分析方法（Analytical Method）因?yàn)椴煌椒ㄒ矔z驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生差異。
14. 問：嬰兒奶粉產(chǎn)品的阪崎腸桿菌依照國標(biāo) GB 4789.40-2016公告方法，檢
測的結(jié)果為3.0 MPN/100 g(mL)，下限為0.15 MPN/100 g(mL)菌量如此低，請問此產(chǎn)品是否可被接受(合格)？
答：不行，其為不合格的嬰兒奶粉。因?yàn)閶雰好看魏纫黄繘_泡牛奶，約
用100 g，甚至更大量奶粉配制，每天喝好幾回，如果以100 g/次計(jì)算，
那么嬰兒喝入的菌量約有3.0 MPN/g(mL)，若以其95%信賴區(qū)間的上限計(jì)算，將達(dá)11 MPN/100 g(mL)，如果每天喝10次牛奶，將可能喝下約1,100 CFU的阪崎腸桿菌，對免疫力低的新生兒將可能引起感染(腦膜炎及敗血癥)。
15. 問：從檢驗(yàn)食品的衛(wèi)生指標(biāo)菌(如生菌數(shù)、大腸菌群/大腸埃希氏菌、腸桿
菌科)或病原菌(阪崎腸桿菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣桿菌或產(chǎn)氣莢膜梭菌)時(shí)，若最可能數(shù)法(MPN)及直接平板法的培養(yǎng)基上沒有微生物生長，是否可以用「陰性或0」提出報(bào)告？
答：不能，所謂陰性及陽性的報(bào)告是針對某一檢測項(xiàng)目的最終綜合判斷結(jié)
果，對于定性的檢測，提出報(bào)告的方式為「檢出或未檢出」/單位樣品，
對于定量的檢測，若以直接平板法定量檢測，一般提出報(bào)告為「小于
稀釋倍數(shù)×1 CFU/單位樣品」﹝例如，選擇十倍稀釋的檢體接種，則為
小于10/ g(mL)或25 g(mL)檢體未檢出某種測試菌﹞。若以最可能數(shù)法(間接定量方法，為統(tǒng)計(jì)學(xué)方法)檢測，一般提出報(bào)告為「小于稀釋倍數(shù)×3 MPN/ g(mL)」﹝例如，選擇0.1，0.01及0.001 g(mL)檢測接種，則為小于3/ g(mL)﹞，其他的報(bào)告方式均不符合國標(biāo)及ISO方法，建議不要使用。雖然食品微生物檢驗(yàn)出現(xiàn)沒有生長是常見的，但結(jié)果報(bào)告的格式應(yīng)為「未檢出/單位樣品」，如國標(biāo)方法中，食品中沙門氏菌的檢測報(bào)告方式為「25 g(mL)未檢出沙門氏菌」。
16. 問：食品衛(wèi)生指標(biāo)菌或病原菌的檢測結(jié)果超標(biāo)(不合格)，可不可以再重新取
同一批號的檢體重測(復(fù)驗(yàn)，復(fù)檢，re-test)？ 若不能，為什么？
答：不能。復(fù)驗(yàn)(re-test)指對檢體的產(chǎn)品進(jìn)行重復(fù)性、再現(xiàn)性或中間精密度
條件下進(jìn)一步測試。復(fù)驗(yàn)用于解決被監(jiān)督者對監(jiān)督產(chǎn)品總體(即核查總
體)結(jié)果判定等事項(xiàng)的異議。一般的要求，檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告后，剩余樣品
和同批產(chǎn)品不進(jìn)行微生物項(xiàng)目的復(fù)檢。這是因?yàn)?span>(1)微生物污染是不均
勻的，采樣方案再科學(xué)，也是基于或然率分布，不可能檢驗(yàn)全部產(chǎn)品。
(2)微生物檢驗(yàn)是破壞性檢驗(yàn)，且試驗(yàn)周期長，一般同一包裝的樣品不
能重復(fù)進(jìn)行微生物試驗(yàn)。(3)微生物在自然環(huán)境中像上帝/佛祖一樣「無
所不在」，并可能經(jīng)由檢驗(yàn)人員、檢驗(yàn)器材、環(huán)境帶入，影響檢驗(yàn)結(jié)果。參考數(shù)據(jù)：李玨。第八屆食品微生物檢測與控制技術(shù)交流會講義。2018。
17. 問：食品中沙門氏菌檢驗(yàn)的增菌液移種平板后長出的懷疑菌落接種TSI瓊
脂斜面，幾小時(shí)后，斜面變黃，基底變黑，但在20~24小時(shí)，斜面變成紅色，而基底變成黑色，該如何判讀結(jié)果？又如果在周末接種TSI瓊脂斜面，是否可培養(yǎng)至周一（培養(yǎng)約56~72小時(shí)）再觀察結(jié)果？如果不能要怎么辦？
答：TSI瓊脂斜面培養(yǎng)后的判讀時(shí)間為20~24小時(shí)，太早判讀，因?yàn)?span>TSI瓊
脂的組成中葡萄糖含量為乳糖和蔗糖的1/10，葡萄糖發(fā)酵性菌先利用葡
萄糖(單醣)產(chǎn)酸，生長開始時(shí)，斜面及基底因葡萄糖的利用而產(chǎn)酸(變
黃)，隨著細(xì)菌的生長，葡萄糖用完，以沙門氏菌為例，因不能發(fā)酵乳
醣或(及)蔗糖，則沙門氏菌開始利用蛋白胨而產(chǎn)堿，將使斜面呈堿性(變
紅)，而基底因?yàn)榱蚧瘹涞漠a(chǎn)生，與鐵作用而產(chǎn)生硫化鐵，使基底變黑。
若為大腸桿菌群的成員將能利用乳糖及(或)蔗糖，將繼續(xù)產(chǎn)酸，使斜面
便呈酸性(紅色)。沙門氏菌因基底變成黑色掩蓋酸性，因此，基底若呈
黑色，將仍然代表酸性的產(chǎn)生(葡萄糖的利用)。志賀氏菌陰部產(chǎn)生硫化
鐵而呈酸性(黃色)，但也如同沙門氏菌，不會利用乳糖或蔗糖，因此，
斜面因利用蛋白胨的利用而變堿性(呈現(xiàn)紅色)。兩菌接種TSI瓊脂后判
讀時(shí)間約20~24小時(shí)，不能等到培養(yǎng)48小時(shí)后才判讀，因?yàn)榉磻?yīng)可能
發(fā)生改變而不易判讀。如果在周末接種TSI瓊脂斜面，可由周末值班同
仁在培養(yǎng)20小時(shí)后將TSI放置冰箱，然后在周一觀察結(jié)果。
18. 問：食品中毒病原菌的定性檢測質(zhì)量管制措施如何操作？
答：微生物定性檢測的質(zhì)量管制措施，在內(nèi)部品管措施方面可包括利用添加
ATCC或CMCC的陽性菌菌株、空白樣品﹝運(yùn)送空白樣品(旅運(yùn)空白)及方法空白(試劑空白)樣品﹞進(jìn)行質(zhì)量管理，操作時(shí)要進(jìn)行二重復(fù)樣品分析，以及建立精密度管制范圍。其他尚有多質(zhì)量管制措施，如培養(yǎng)基和試劑的品管、人員培訓(xùn)、標(biāo)準(zhǔn)菌株保存及移種代數(shù)的限制以及在外部品管措施方面，應(yīng)定期參加ISO17043認(rèn)證的能力試驗(yàn)提供單位的能力考核等，這些質(zhì)量管制措施確實(shí)執(zhí)行，才能確保檢測過程得到良好控制以及得到可信賴的最終報(bào)告。
19. 問：我們食品廠的品管檢驗(yàn)室為小型，因?yàn)榭臻g不大，且人力受限，不能
操作太復(fù)雜的檢驗(yàn)，請問要如何規(guī)劃微生物的檢驗(yàn)？
答：近年來，食安的問題受到社會大眾的重視，受惠于2016國標(biāo)腸桿菌科檢驗(yàn)方法以及衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)，目前已可在檢驗(yàn)的隔天提出報(bào)告，檢驗(yàn)的方法為傾注（直接）平板法，檢驗(yàn)室若已經(jīng)購買一臺生物安全柜外，一臺水浴，一臺培養(yǎng)箱及一臺微波爐以及一些基本檢驗(yàn)設(shè)備﹝如接種針、強(qiáng)力紅外線電熱滅菌器(Incinerator)﹞，以及一臺高壓滅菌器將足以操作腸桿菌科的檢驗(yàn)，不僅符合法規(guī)，且能快速提出精準(zhǔn)的報(bào)告，這些檢驗(yàn)器材及各種成品培養(yǎng)基可購自啟新公司(蘇州高新區(qū))。至于較復(fù)雜的檢驗(yàn)，如MPN法、生化或血清學(xué)試驗(yàn)、病原菌檢驗(yàn)可委托認(rèn)證的第三方檢驗(yàn)室（如 SGS，歐陸公司）進(jìn)行。至于檢驗(yàn)室的要求為P2 lab，只要具有雙門的房間，進(jìn)出進(jìn)行管控，檢驗(yàn)人員必須穿著實(shí)驗(yàn)衣、戴帽套及口罩，并且經(jīng)過訓(xùn)練足以勝任微生物檢驗(yàn)工作，上述的設(shè)備已經(jīng)可以滿足要求。
20. 問：檢驗(yàn)室及無菌操作臺裝設(shè)紫外線(UV)燈，如何確認(rèn)其具有殺菌功能？
答：檢驗(yàn)室裝設(shè)紫外線燈的目的系要符合國標(biāo)食品微生物檢驗(yàn)方法中有關(guān)工
作環(huán)境的要求，即每15分鐘落菌數(shù)不得超過15 CFU/培養(yǎng)皿，同時(shí)也要確保無菌操作臺達(dá)到微生物檢驗(yàn)的合適環(huán)境。新成立的檢驗(yàn)室要購買新的燈管，波長為254 nm(通常裝設(shè)在實(shí)驗(yàn)室的天花板，燈罩朝上，燈管不可以有反光罩，因?yàn)?span>UV燈的光線不能穿透任何物質(zhì)，因此，若有遮蓋，將無法殺菌。除了利用紫外線檢測儀定期檢測紫外線強(qiáng)度外，也可以UV燈開啟約30分鐘后，當(dāng)要進(jìn)入房間，關(guān)燈后仍可聞到一股味道，則代表UV燈仍然有滅菌效果。另外，可制備低濃度(約100~250 CFU)的細(xì)菌懸浮液(金黃色葡萄球菌或綠膿桿菌)，以棉棒操作涂抹法的方式涂抹于TSA、PCA、TGEA、NA等，雙重復(fù)，取一個(gè)平板在距離紫外燈管約1 m內(nèi)，打開蓋子照射10~30分鐘，然后將照射的平板與未照射(覆蓋)的平板(對照組)在35 ℃培養(yǎng)48小時(shí)，比較2個(gè)平板的生長情形，若開蓋平板的UV燈的殺菌力達(dá)到99%以上，則指出紫外燈具有殺菌效果。
參考文獻(xiàn)：食品微生物檢驗(yàn)問答集錦
21. 問：食品微生物檢驗(yàn)時(shí)，為什么要將接種檢體的平板倒置培養(yǎng)？但有時(shí)又
規(guī)定要正放培養(yǎng)，他們對結(jié)果有何影響？是否有差別？
答：一般食品微生物檢驗(yàn)接種檢體的平板要倒放培養(yǎng)。倒置時(shí)平板內(nèi)空氣較
不流通，較能夠防止外界微生物的污染(培養(yǎng)箱的空氣通常沒有經(jīng)過消
毒，可能有污染菌存在)。同時(shí)，倒置時(shí)培養(yǎng)基的水分不易蒸發(fā)，可維持培養(yǎng)基的濕度，能促進(jìn)微生物的活性。又平板倒置時(shí)，水蒸氣不會停留在蓋子上，有利于培養(yǎng)后生長菌落的觀察。但霉菌的檢驗(yàn)則不一樣，需要將培養(yǎng)皿正放培養(yǎng)，這是因?yàn)槊咕鷷a(chǎn)生芽孢，若倒放，因?yàn)楦羧找苿悠桨暹M(jìn)行檢視的關(guān)系，將會導(dǎo)致孢子的飛散而污染平板上未生長的培養(yǎng)基部分。所以霉菌檢驗(yàn)時(shí)，勿倒置培養(yǎng)及重迭超過3個(gè)以上，培養(yǎng)期間不可以移動平板以防止孢子散落。
參考文獻(xiàn)：食品微生物檢驗(yàn)問答集錦
22. 問：食品的生菌數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果包括霉菌及酵母菌嗎？
答：國標(biāo)方法對生菌數(shù)的的檢驗(yàn)定義為「食品檢體經(jīng)過處理，在一定條件下
(如特殊指定的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等)培養(yǎng)后，所得到的每 g(mL)檢體中形成的微生物菌落總數(shù)。生菌數(shù)所使用的培養(yǎng)基為PCA平板，由于PCA平板上，除了一般細(xì)菌會生長外，霉菌和酵母等其它微生物若能生長，也將包括在生菌數(shù)計(jì)數(shù)的范圍內(nèi)。若僅針對霉菌及酵母菌進(jìn)行檢測，則另外使用PDA作為接種培養(yǎng)基以及另外指定的培養(yǎng)溫度。
23. 問：國標(biāo)是否有公告食品微生物的快速檢測方法？快速檢測法可應(yīng)用在食
品產(chǎn)業(yè)界的品管室嗎？
答： 國標(biāo)食品微生物的快速檢測方法僅提到病原菌的分子診斷技術(shù)，
包括一般的PCR、實(shí)時(shí)PCR、多重PCR及反轉(zhuǎn)錄酶PCR，這些分子診
斷技術(shù)常作為食品中病原細(xì)菌或毒素的確認(rèn)試驗(yàn)以及病原病毒的檢測方
法。最近一些新興的技術(shù)，如干式薄膜快檢培養(yǎng)基、TEMPO微生物自動計(jì)數(shù)系統(tǒng)(自動化MPN法的設(shè)備)、快速微生物計(jì)數(shù)的DOX自動計(jì)數(shù)系 統(tǒng)、PrecisTM病原菌檢測方法、RapidChek Strips病原菌免疫快速檢測片、病原菌ELISA及乳膠凝集試驗(yàn)之免疫檢測法以及Pathatrix Auto System全自動微生物病原菌濃縮與純化系統(tǒng)(詳細(xì)可參閱蔡文城，蔡岳廷。食品微生物檢驗(yàn)技術(shù))。2019: 637-652。除了上述快檢方法外，近年來發(fā)展的鑒定系統(tǒng)包MALDI-TOF MS系統(tǒng)、流式細(xì)胞儀、NGS測序技術(shù)也正在或?qū)⒁獞?yīng)用于食品中毒病原菌的快速檢測。
國標(biāo)食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)是國家標(biāo)準(zhǔn)方法，具有法律效力，是不可以替代的。一般而言，食品的出廠檢測、衛(wèi)生單位的執(zhí)法、第三方認(rèn)證檢驗(yàn)室出具報(bào)告必須采用國標(biāo)方法進(jìn)行檢測。國標(biāo)方法除了分子診斷外，普遍使用培養(yǎng)法，但因?yàn)闄z驗(yàn)步驟繁瑣，獲得報(bào)告時(shí)間較長，因此在企業(yè)內(nèi)部對生產(chǎn)的內(nèi)部質(zhì)量監(jiān)控檢測，如原料的檢測、生產(chǎn)過程中產(chǎn)品的監(jiān)測、消毒滅菌效果檢測、生產(chǎn)環(huán)境的監(jiān)測、水的監(jiān)測等都可以采用快速檢測方法，雖如此，但僅可能利用樣本的增菌培養(yǎng)液進(jìn)行操作。另外，依照國標(biāo)或ISO 17025認(rèn)證的要求，所選擇的快速檢測法/食品組合，必須與國標(biāo)方法進(jìn)行比對，若檢測方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性符合才可采用。
24. 問：分子診斷技術(shù)應(yīng)用于食品微生物的偵測，是否可以直接利用檢體操作？
答：一般食品病原菌的檢驗(yàn)必須從培養(yǎng)后的檢體增菌液或分離培養(yǎng)基上的純
菌落萃取目標(biāo)菌的核酸，若直接利用檢體萃取再進(jìn)行分子診斷，呈陽性
的機(jī)率甚低，因?yàn)橐话悴≡谑称窓z體中的菌量都很少，經(jīng)過增菌，
檢出機(jī)會才能增加。例外的情況是乳酸菌或已經(jīng)知道由菌體粉末或菌懸
浮液組成的健康食品，則可直接進(jìn)行核酸萃取，再進(jìn)行目標(biāo)菌的檢驗(yàn)。
25. 問：參觀某食品檢驗(yàn)室，發(fā)現(xiàn)他們操作生菌數(shù)，將每星期需的PCA培養(yǎng)基
用量一次配制數(shù)瓶，滅菌后，放在60℃的培養(yǎng)箱存放，進(jìn)行生菌數(shù)再
取出倒平板，以節(jié)省每天配制的時(shí)間，覺得怪怪的，這種操作方式是
正確的嗎？
答：大錯(cuò)特錯(cuò)，培養(yǎng)基最怕加熱過度，加熱過度的情況包括培養(yǎng)基配制時(shí)煮
太久、高壓滅菌太久、高壓滅菌后降至一大氣壓沒有在最短時(shí)間內(nèi)取
出、滅菌后放在水浴太久才用于檢驗(yàn)、煮溶超過一次以上等狀況。一次
配制大量瓊脂培養(yǎng)基存放在60℃的培養(yǎng)箱或水浴保持呈液體狀態(tài)，然
后在幾天內(nèi)使用，是非常錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)室操作，因?yàn)轲B(yǎng)分都破壞殆盡，這
也是為甚么實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)合格，但地方主管單位抽查卻不合格的最重要原
因，這種檢驗(yàn)是「自我感覺良好的檢驗(yàn)、自欺欺人的檢驗(yàn)、沒有意義的
檢驗(yàn)」。TAF或TFDA認(rèn)證時(shí)，技術(shù)委員要特別了解檢驗(yàn)室是否有這種
錯(cuò)誤的操作方式。PCA或SDA、VRBGA等傾注平板使用的培養(yǎng)基僅可
煮溶一次，煮溶后要立即冷卻至約60~70℃，然后置于47℃的水浴，在
最短的時(shí)間內(nèi)使用，若檢體量太多，應(yīng)該分批煮沸，以免放在47℃的
水浴太久，而破壞培養(yǎng)基中的養(yǎng)分。
26. 問：配制金黃色葡萄球菌食品檢驗(yàn)用的Baird-Parker medium(B-P)分離培
養(yǎng)基，接種ATCC或CMCC標(biāo)準(zhǔn)菌發(fā)現(xiàn)其在B-P上的菌落呈圓形，表面凸起、平滑，呈灰黑色或黑色，菌落周圍透明環(huán)(卵磷脂酶反應(yīng))很明顯，但并沒有黑色混濁帶或淡黑色混濁帶(沉淀)不明顯，這是什么原因造成的？
答：Baird-Parker medium(B-P)分離培養(yǎng)基含有丙酮酸鈉、氯化鋰(LiCl2)、甘
胺酸(glycine) 、亞碲酸鉀(potassium tellurite)，同時(shí)含有卵黃(egg yolk)
成分，可用于偵測測試菌是否有能力產(chǎn)生卵磷脂酶及脂酶，有時(shí)金黃色
葡萄球菌部會呈現(xiàn)應(yīng)有的典型菌落特征，這可能與培養(yǎng)基配制與接種的
時(shí)間間隔太久有關(guān)。又金黃色葡萄球菌可將卵黃中的磷脂分解為磷酸膽
堿(phosphocholine)及甘油二酯(diglyceride)，甘油二酯進(jìn)一步被脂酶分解
成脂訪酸，脂肪酸遇鈣、鎂等離子，則會產(chǎn)生沉淀。如果產(chǎn)生過量的磷
酸鹽會影響金黃色葡萄球菌產(chǎn)生脂酶。如果Baird-Parker medium(B-P)培
養(yǎng)基配制太久，接種檢體時(shí)可加入丙酮酸鈉(每一平板加入約0.5 mL的
0.4%無菌丙酮酸鈉溶液)，讓其擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，而可讓損傷的金黃色葡
萄球菌復(fù)蘇及刺激該菌的生長。
