0512-86860966
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前言
B 群鏈球菌(Group B Streptococcus； GBS；Streptococcus agalactiae)為一種革蘭 氏陽(yáng)性球菌，常棲息於生殖泌尿道與腸胃道
的共生菌，通常帶菌者不會(huì)出現(xiàn)癥狀，但因 新生兒抵抗力較低，容易透過(guò)母親垂直感染， 是造成新生兒敗血癥之最大殺手；既使治癒 後依然會(huì)有約30%帶有神經(jīng)系統(tǒng)的後遺癥， 例如：聽(tīng)力或是視力受損、學(xué)習(xí)與運(yùn)動(dòng)障礙 或是腦性麻痺等[1-2]。
目前衛(wèi)福部建議懷孕35-37週孕婦應(yīng)進(jìn) 行篩檢，透過(guò)棉拭採(cǎi)檢陰道及直腸末端後， 接著把拭子接種在 Carrot broth、Lim broth或 Trans-Vag broth 中，若種在 Carrot broth 中於35-37℃的 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí) 後，發(fā)現(xiàn)有胡蘿蔔色即可發(fā)出 GBS 陽(yáng)性報(bào) 告，若無(wú)則再移種至其他平板培養(yǎng)基；而種 在Lim broth或Trans-Vag broth中於35-37℃ 的 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)後，全部需劃 種於平板培養(yǎng)基，並再於35-37℃的 CO2 培 養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)後，若有疑似菌落再進(jìn) 行鑑定試驗(yàn)後才可發(fā)出報(bào)告[3]。 檢測(cè)GBS的流程中必需將檢體增菌後再 移種，目的為增加GBS的分離率[4]，而在臺(tái) 灣[2-4]及國(guó)外的研究[5]中有提及GBS的增菌培 養(yǎng)液可選用Carrot broth, Lim broth及 TransVag broth，而移種的培養(yǎng)基可選用 BAP、 CNA、CHROMagar StreptB及GBS DetectTM， 而在臺(tái)灣則有新設(shè)計(jì)的分離培養(yǎng)基-CMPTM Carrot agar及 / GBS detection agar bi-plate [6-8]皆可以很方便地分離GBS。 Lim broth[5, 9]為含 colistin 及 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培養(yǎng)液，可抑制革蘭氏 陰性桿菌的生長(zhǎng)。也有研究報(bào)告顯示[11]，檢 體增菌後的GBS分離率優(yōu)於未增菌者，原因 可能是抑制其他陰道/直腸菌群，但此增菌方 法須經(jīng)過(guò)多次培養(yǎng)確認(rèn)，將會(huì)延遲報(bào)告[10]。 Trans-Vag broth[5, 11]為含5%綿羊血、 gentamicin 及 nalidixic acid 之 Todd-Hewitt 培養(yǎng)液，大致上與 Lim broth 相同只差使用 的抗生素種類不同與額外添加5%綿羊血。 Gentamicin 和nalidixic acid可抑制部分革蘭 氏陰性菌，添加5%綿羊血目的為提供更佳的 營(yíng)養(yǎng)分以增加GBS的生長(zhǎng)。 CMPTM Carrot broth[5, 12]為一種液態(tài)增 菌/鑑別培養(yǎng)基，含 GBS 生長(zhǎng)所需物質(zhì)及抑 制其它非鏈球菌的抗生素，並含少量瓊脂與 特殊養(yǎng)份促使 溶血型 GBS 顯色，陽(yáng)性反應(yīng) 會(huì)產(chǎn)生胡蘿蔔色。先前研究報(bào)告指出， -GBS 在Carrot broth產(chǎn)生胡蘿蔔色具有100%的專 一性[13]，因此產(chǎn)色即可發(fā)出陽(yáng)性報(bào)告[3]，可以減少再次移種所需的人力、物力。 雖然GBS在BAP的生長(zhǎng)菌落大多呈 溶 血型（菌落周圍完全溶血），但仍有約3-5% 的菌落呈 溶血型（不溶血）且在Carrot broth 中不顯色，為能夠確切檢測(cè)出所有GBS，可 搭配使用GBS detection agar，相關(guān)研究報(bào)告 指出CMPTM / GBS detection agar及 Hardy GBS DetectTM會(huì)誘導(dǎo) 溶血型GBS呈現(xiàn) 溶血 型，將可提高 溶血型 GBS 偵測(cè)的靈敏度與 分離率[14-15]。 本研究比較目前GBS檢測(cè)常用的三種增 菌培養(yǎng)液(Carrot broth, Lim broth 及 TransVag broth)的效能，除了測(cè)試此三種增增菌培 養(yǎng)液的偵測(cè)極限，也與三種常見(jiàn)產(chǎn)道棲息菌 混合接種，以了解GBS在偵測(cè)中可能受到的 干擾。
材料與方法
試驗(yàn)菌株 本研究選用的測(cè)試菌株包括五株標(biāo)準(zhǔn)菌 種，Streptococcus agalactiae (ATCC 12386)、 Streptococcus agalactiae (ATCC13813)，Enterococcusfaecalis(ATCC29212)，Staphylococcus aureus (ATCC 25923)與 Escherichia coli (ATCC 25922)。上述五種菌株皆保存在-70℃ 的 GermBank 菌種保存管（啟新生物科技公 司，新北市），試驗(yàn)前取出接種在 BAP 於 35-37℃的CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)，共活 化兩次。
增菌培養(yǎng)液、移種培養(yǎng)基與試劑 本研究使用的增菌培養(yǎng)液包含 CMPTM Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth， 以及移種培養(yǎng)基BAP與 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar之 bi-plate和系列 稀釋使用的Tryptic soy broth (TSB) 培養(yǎng)液， 皆由啟新生物科技有限公司（新北市，臺(tái)灣） 提供。
三種增菌培養(yǎng)液的偵測(cè)極限 分別將 與 -GBS用TSB調(diào)至McFarland no 0.5 (1.5×108 CFU/mL)，再進(jìn)行10倍系 列稀釋至103-10 CFU/mL，並各取0.1 mL分 別接種在CMPTM Carrot broth、Lim broth及 Trans-Vag broth中（實(shí)際接種菌量為102-100 CFU），接種完後，置於35-37℃的 CO2 培 養(yǎng)箱培養(yǎng)，18-24小時(shí)後觀察每一增菌液的 顏色變化，再以四區(qū)及三區(qū)劃線分別移種於 BAP與CMPTM Carrot agar及 / GBS detection agar之bi-plate，並於35-37℃的CO2 培養(yǎng)箱 培養(yǎng)18-24小時(shí)，觀察菌落是否生長(zhǎng)與是否 有胡蘿蔔色及溶血菌落的產(chǎn)生。
三種增菌培養(yǎng)液的干擾試驗(yàn) 依照上述實(shí)驗(yàn)得到GBS在各增菌培養(yǎng)液 中的偵測(cè)極限，再分別將Enterococcus faecalis (ATCC 29212)，Staphylococcus aureus (ATCC 25923)與 Escherichia coli (ATCC 25922)利 用TSB調(diào)至相當(dāng)於McFarland no 0.5標(biāo)準(zhǔn)液， 並進(jìn)行十倍系列稀釋，將 與 -GBS固定菌量 104 CFU，和其餘三種干擾菌分別以10:1、 1:1、1:10之比例混合，然後都取0.1 mL 分 別接種於CMPTM Carrot broth、Lim broth及 Trans-Vag broth 中，接種完後置於35-37℃ 的 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)，待增菌後觀 察每一增菌液的顏色變化，再以四區(qū)及三區(qū) 劃線分別移種於BAP與 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate，並於 35-37℃的CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)，觀察 菌落是否生長(zhǎng)與是否有胡蘿蔔色及溶血菌落 的產(chǎn)生。
結(jié)果 與 -GBS在三種增菌培養(yǎng)液的偵測(cè)極限 將 102-100 CFU的 與 -GBS分別接種在 Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth， 並於35-37℃的CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)後觀察顏色變化，並接種在CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate，於 35-37℃的CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)後觀察 培養(yǎng)基上的菌落顏色及形態(tài)。 -GBS： -GBS 於 Carrot broth 中在菌 量高於10 CFU 時(shí)皆產(chǎn)生胡蘿蔔色，偵測(cè)率 皆為100% (3/3)，不過(guò)若是菌量為1 CFU時(shí) 則沒(méi)有顯色，不過(guò)卻在 CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar之 bi-plate中有其 中兩片產(chǎn)生胡蘿蔔色菌落，偵測(cè)率降低為 66.7% (2/3)；在 Lim broth 中，當(dāng)菌量高於 10 CFU時(shí)，偵測(cè)率為100% (3/3)，若是菌量 為 1 CFU時(shí)則降低為0% (0/3)；在Trans-Vag broth中，當(dāng)菌量高於10 CFU時(shí)，偵測(cè)率為 100% (3/3)，若是菌量為1 CFU時(shí)則降低為 66.7% (2/3)。（表1） -GBS： -GBS 於 Carrot broth 中在菌 量高於10 CFU時(shí)的偵測(cè)率皆為100% (3/3)， 不過(guò)若是菌量為1 CFU時(shí)則降低為33.3% (1/3)；在Lim broth中，當(dāng)菌量高於10 CFU 時(shí)，偵測(cè)率為66.7% (2/3)，若是菌量為1 CFU時(shí)則降低為0% (0/3)；在Trans-Vag broth 中，當(dāng)菌量高於10 CFU時(shí)，偵測(cè)率為100% (3/3)，若是菌量為1 CFU時(shí)則降低為33.3% (1/3)。（表1）
與 -GBS在三種增菌培養(yǎng)液的干擾試驗(yàn) 本研究將Enterococcus faecalis，Staphylococcus aureus與Escherichia coli以 10:1、 1:1、1:10之比例分別與 與 -GBS 混合，並 接種在Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth 並於35-37℃的 CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24 小時(shí)後觀察顏色變化，並接種在CMPTM Carrot agar 及 / GBS detection agar 之 bi-plate， 並於35-37℃的CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24小時(shí)後 觀察培養(yǎng)基上的菌落顏色及形態(tài)。 -GBS： -GBS 於 Carrot broth 中與其 他三種菌以三種比例混合培養(yǎng)後，其中，與S. aureus 與 E.coli 混合的三種比例皆100% (3/3)產(chǎn)生胡蘿蔔色，而與E. faecalis以 10:1 或是1:1混合也不會(huì)干擾到胡蘿蔔色產(chǎn)生， 不過(guò)若是 -GBS與E. faecalis以 1:10混合的 話則不產(chǎn)生胡蘿蔔色(0/3)，必需接種到CMP TM Carrot agar及 / GBS detection agar之 bi-plate後，才在其中一片培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)胡蘿 蔔色的菌落(1/3)。此外， -GBS 於Lim broth 及Trans-Vag broth中與其他三種雜菌混合培 養(yǎng)之後，S. aureus與 E.coli也不會(huì)干擾到 GBS的偵測(cè)，偵測(cè)率為100% (3/3)，只有當(dāng) -GBS 與 E. faecalis 以 1:10混合才會(huì)影響到 其偵測(cè)的能力，偵測(cè)率分別為0% (0/3)及 66.7% (2/3)（表2）。 -GBS： -GBS 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 -GBS 相 似，在Carrot broth、Lim broth及Trans-Vag broth 中，S. aureus 與 E.coli 並不會(huì)干擾 GBS的偵測(cè)，只有 -GBS與 E. faecalis以 1: 10混合才會(huì)影響到其偵測(cè)的能力，偵測(cè)率分 別為33.3% (1/3)、0% (0/3)及 33.3% (1/3) （表2）。
討論
GBS常用的三種增菌培養(yǎng)液CMPTM Carrot broth, Lim broth及Trans-Vag broth，在之前 的研究報(bào)告皆有指出可有效增加GBS生長(zhǎng)， 有助於 GBS 在平板培養(yǎng)基上的分離率[4-5]。 此次研究比較三種增菌培養(yǎng)基的效能，結(jié)果 指出三種增菌培養(yǎng)液對(duì)於 -GBS都可以100% 偵測(cè)到10 CFU 以上的菌量，若是 -GBS 為 1 CFU 時(shí)，Carrot broth 及 Trans-Vag broth 依然有66.7%的偵測(cè)率，不過(guò)Lim broth則為 0%（表1）。先前研究指出，Carrot broth對(duì) 於 -GBS 具有100%產(chǎn)生胡蘿蔔色的專一性 [14]，而在本研究中觀察到當(dāng) -GBS菌量為10 CFU 以上時(shí)，Carrot broth 皆可產(chǎn)生典型胡 蘿蔔色，不過(guò)在菌量為1 CFU 時(shí)，Carrot broth卻不產(chǎn)色，需要移種至同樣能使 -GBS
產(chǎn)生胡蘿蔔色的平板培養(yǎng)基後，才能鑑定 出 -GBS，這是由於當(dāng)菌量過(guò)低時(shí)， -GBS 在 Carrot broth 內(nèi)的分佈不集中，因此即使 產(chǎn)色也無(wú)法輕易用肉眼觀察，此時(shí)只能增長(zhǎng) 培養(yǎng)時(shí)間或是移種到平板培養(yǎng)基進(jìn)行二次增 菌才可以觀測(cè)到 -GBS。啟新生物科技公司 所研發(fā)的 CMPTM GBS TransCultSwab 也具 有產(chǎn)生胡蘿蔔色的能力，與 Carrot broth 不 同的地方在於CMPTM GBS本身即為採(cǎi)檢管， 在 35-37℃保存時(shí)能即時(shí)增菌，也因?yàn)槠錇?半固態(tài)培養(yǎng)基，更能讓檢體內(nèi)的GBS即時(shí)增 菌以及維持厭氧的環(huán)境，因此在臨床上的應(yīng) 用上比Carrot broth有更好的效能[16-19]。 對(duì)於 -GBS的偵測(cè)極限，Carrot broth及 Trans-Vag broth都可以100%的偵測(cè)到10 CFU 以上的菌量，若是菌量為1 CFU 時(shí)，只有 33.3%的偵測(cè)率。而Lim broth對(duì)於 -GBS的 偵測(cè)極限，當(dāng)菌量為10 CFU時(shí)為66.7%，1 CFU時(shí)為0%，這可能是由於Lim broth中所 含的養(yǎng)分相對(duì)於其他兩種增菌培養(yǎng)液較低， 因此Lim broth對(duì)於低菌量的增菌效果較差。 將Enterococcus faecalis，Staphylococcus aureus 與 Escherichia coli 以 10:1、1:1、1: 10之比例分別與 與 -GBS混合進(jìn)行GBS的 干擾試驗(yàn)，經(jīng)由三種增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)後，結(jié) 果顯示S. aureus與E. coli在任何比例下，均 不影響 與 -GBS的生長(zhǎng)，是由於三種增菌液 中皆有添加特定的抗生素來(lái)抑制革蘭氏陰性 菌，還有除了鏈球菌以外的革蘭氏陽(yáng)性菌。 不過(guò)針對(duì) E. faecalis，當(dāng) E. faecalis 的菌量 高於 與 -GBS 10倍以上時(shí)，就會(huì)干擾GBS 的生長(zhǎng)（表2），也間接影響 -GBS在Carrot broth中的產(chǎn)色。 綜合上述研究結(jié)果，對(duì)GBS來(lái)說(shuō)，CMP TM Carrot broth及 Trans-Vag broth 具有較相 近的增菌能力，而 Lim broth 相較於其他兩 種增菌液，增菌能力顯然地較為不足。其中 Carrot broth更具有產(chǎn)生胡蘿蔔色的效能，一旦產(chǎn)色即可判定為 -GBS，不需要再移種至 其他培養(yǎng)基，可以省下更多的人力、物力以 及時(shí)效[16-18]。本次研究所用的三種增菌液接 對(duì)於臨床上的雜菌都具有一定的抑菌性，唯 一會(huì)造成影響的是 E. faecalis，不過(guò)由於 E. faecalis 在分類與結(jié)構(gòu)上都與 GBS 相近，因 此目前難以在培養(yǎng)的階段專一性地抑制E. faecalis.
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