檢驗(yàn)或活化黴菌及酵母菌常使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar, PDA)，因?yàn)镻DA含有 豐富碳素源及氮素源，一些乳酸菌亦可於此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，用於檢測(cè)含活性乳酸菌食品時(shí)易導(dǎo)致偽陽性的 產(chǎn)生而誤判檢測(cè)結(jié)果。本研究以酸液調(diào)整PDA之pH值使乳酸菌在酸化PDA中不生長(zhǎng)，而維持黴菌及酵母 菌之生長(zhǎng)活性。研究結(jié)果顯示在pH 2.5~3.5環(huán)境下，乳酸菌在PDA無法生長(zhǎng)，但黴菌及酵母菌不受低pH 環(huán)境影響，因此吾等認(rèn)為利用酸化PDA檢測(cè)乳酸菌食品中的黴菌及酵母菌將更為準(zhǔn)確。
前言
臺(tái)灣保健食品市場(chǎng)規(guī)模隨著我國(guó)健康意 識(shí)提升而成長(zhǎng)，2017年通過審查的保健食品 前五大功效訴求為調(diào)節(jié)血脂、胃腸功能改善、 免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝、骨質(zhì)保健[1]。根據(jù)國(guó)內(nèi)外 研究顯示乳酸菌有改善腸道菌相、增強(qiáng)免疫 功能、降膽固醇、降血脂或減少體脂肪形成 等功效，食品中常以乳酸菌做為益生菌原料。 隨著國(guó)人生活水平上升，對(duì)於食品衛(wèi)生要求 愈發(fā)嚴(yán)格。檢測(cè)方法進(jìn)行含乳酸活菌產(chǎn)品時(shí)， 若是以PDA為檢測(cè)培養(yǎng)基，檢測(cè)結(jié)果容易因 乳酸活菌生長(zhǎng)於PDA中而有偽陽性。目前市 面上已有多種乳酸活菌產(chǎn)品，然而檢驗(yàn)乳酸 活菌產(chǎn)品中黴菌及酵母菌時(shí)，因乳酸活菌能 生長(zhǎng)於PDA上，導(dǎo)致不易判斷產(chǎn)品是否被黴 菌或酵母菌所污染。文獻(xiàn)指出酸可抑制乳酸
菌生長(zhǎng)[2]，而黴菌及酵母菌耐酸性較佳[3]， 因此本研究欲以酸液調(diào)整PDA之 pH值，在 不影響黴菌及酵母菌生長(zhǎng)的前提下，使乳酸 活菌不生長(zhǎng)於PDA上。
材料與方法
培養(yǎng)基、試劑 BD DifcoTM Potato Dextrose Broth（馬 鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基；PDB）、BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth（乳酸桿菌 MRS 培 養(yǎng)基）、BD DifcoTM Agar（洋菜）皆購買自 啟新生物科技有限公司，新北市。鹽酸(HCl) 購自Sigma-Aldrich（德國(guó)）、85%磷酸(H3PO3) 購自第一化工原料股份有限公司（臺(tái)灣）、 檸檬酸(Cirtric acid)購自三?；す煞萦邢?公司（中國(guó)）、蘋果酸(Malic acid)購自國(guó)華 貿(mào)易股份有限公司（日本）。
10%(w/w)酸液製備 將 37%鹽酸、85%磷酸、檸檬酸粉末、 蘋果酸粉末分別加入無菌水中混勻至濃度為
10%(w/w)，以0.22 m filter 過濾至無菌離 心管內(nèi)備用。
實(shí)驗(yàn)菌種 Lactobacillus plantarum (BCRC 10069)、 Lactococcus lactis (BCRC 12312)、Lactobacillus rhamnosus (BCRC 16000)、Lactobacillus paracasei (BCRC 16100)、Pediococcus pentosaceus (BCRC 10068)、Aspergillus oryzae (BCRC 30289)、Saccharomyces cerevisiae (BCRC 21800)以上菌株皆購自財(cái)團(tuán)法人食品 工業(yè)發(fā)展研究所生資中心（新竹，臺(tái)灣）。
菌株活化 乳酸菌菌液製備 : 將乳酸菌冷凍保存管 以無菌接種環(huán)沾取至Lactobacilli MRS平板 進(jìn)行四區(qū)劃線，倒置37℃於厭氧環(huán)境培養(yǎng) 48±2小時(shí)，培養(yǎng)完畢再將單一菌落以無菌接 種環(huán)沾取至Lactobacilli MRS Broth中，37℃ 於厭氧環(huán)境培養(yǎng)16~18小時(shí)。 真菌菌液製備 : 將黴菌或酵母菌之純菌 冷凍保存管以無菌接種環(huán)進(jìn)行四區(qū)劃線接種 至PDA平板，正放25℃培養(yǎng)5-7天，活化後 真菌平板以無菌接種環(huán)取單一菌落接種至 PDB，培養(yǎng)於25℃培養(yǎng)5-7天備用。
酸化馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基（酸化 PDA） 製備 將 PDB 粉末加入總體積2% Agar，以 121℃高溫高壓滅菌15分鐘，冷卻至45-50℃， 加入先前製備好之酸液由pH 5.1調(diào)整pH至 3.8、3.5、3.0與 2.5。 酸化 PDA 配製方法經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表 1，不同酸液調(diào)整至pH 3.8 (±0.1)使用酸液量 不同。 由 HCl配製酸化PDA調(diào)整至不同pH值 使用酸量如表2。
乳酸菌數(shù)檢測(cè) 利用傾注平板法進(jìn)行乳酸菌數(shù)計(jì)數(shù)，操 作方法如下：取乳酸活菌菌液1 mL以 1% peptone water 進(jìn)行序列稀釋，稀釋至10-6、 10-7，各稀釋液分別取1mL 至無菌培養(yǎng)皿， 再倒入15~20 mL經(jīng)滅菌完成冷卻至45-50℃ 之Lactobacilli MRS agar，執(zhí)行平板兩重覆， 待平板冷卻凝固後倒置培養(yǎng)於37℃厭氧環(huán)境 48 ± 2小時(shí)，培養(yǎng)後計(jì)數(shù)平板上的單一菌落， 菌落計(jì)數(shù)範(fàn)圍介於25~250 CFU 之間，兩平 板菌落數(shù)平均後得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
黴菌與酵母菌檢測(cè) 利用傾注法進(jìn)行真菌活性檢測(cè)，操作方 法如下：將活化好之真菌菌液，經(jīng)培養(yǎng)後以 傾注平板法培養(yǎng)於PDA 於 25℃培養(yǎng)5-7天， 觀察生長(zhǎng)活性狀況。
乳酸菌於PDA上生長(zhǎng)活性測(cè)試 同上述乳酸菌檢測(cè)方式，將乳酸菌以傾 注平板法檢測(cè)，培養(yǎng)條件比照黴菌與酵母菌， 培養(yǎng)基使用PDA取代Lactobacilli MRS agar， 倒置培養(yǎng)於25℃培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)後計(jì)數(shù)平 板上的單一菌落，菌落計(jì)數(shù)範(fàn)圍介於25~250 CFU之間，兩平板菌落數(shù)平均後得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
酸性PDA對(duì)於乳酸菌與真菌生長(zhǎng)活性測(cè)試 乳酸菌實(shí)驗(yàn)方法同上述乳酸菌於PDA上 生長(zhǎng)活性測(cè)試，使用培養(yǎng)基為酸化PDA，倒 置培養(yǎng)於25℃培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)後計(jì)數(shù)平板 上的單一菌落，菌落計(jì)數(shù)範(fàn)圍介於25~250 CFU之間，兩平板菌落數(shù)平均後得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 黴菌與酵母菌實(shí)驗(yàn)方法同上述黴菌與酵 母菌檢測(cè)，將黴菌、酵母菌以傾注法於各酸 化PDA，正放於25℃培養(yǎng)5-7天，經(jīng)培養(yǎng)後 觀察菌落型態(tài)生長(zhǎng)活性狀況。
結(jié)果
為評(píng)估乳酸菌於PDA之生長(zhǎng)狀況，本研 究將乳酸菌活化後經(jīng)序列稀釋至適當(dāng)稀釋倍 數(shù)後以傾注培養(yǎng)於MRSA及PDA，結(jié)果如表 3 所示，乳酸菌以傾注平板法接種於 MRS agar 及 PDA，乳酸菌於兩種培養(yǎng)基皆可生 長(zhǎng)，並且其菌落數(shù)目無明顯差異。乳酸菌於 MRSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)活性較佳，菌落呈白色 明顯肉眼可見，但由於PDA是黴菌與酵母菌 通用培養(yǎng)基，乳酸活菌雖然可以生長(zhǎng)於此培 養(yǎng)基上，但對(duì)於部分乳酸菌較為不適，而生 長(zhǎng)出的乳酸菌菌落形態(tài)會(huì)偏細(xì)小，較不易計(jì) 數(shù)。 藉由不同酸液調(diào)整至 pH 3.8之 PDA 確 認(rèn)乳酸菌於一般酸化PDA生長(zhǎng)活性。由表4 結(jié)果顯示部分乳酸菌由調(diào)整至pH 3.8 PDA傾 注培養(yǎng)幾乎沒有活性，但是 Lactobacillus plantarum 較為耐酸，活性較強(qiáng)，於 pH 3.8 之 PDA中菌數(shù)與MRS agar中菌數(shù)無明顯差 異。 以不同酸液調(diào)整pH值之PDA皆可抑制 大部份乳酸菌的生長(zhǎng)（表4）。以此結(jié)果可 推斷以調(diào)整 pH 方式可以抑制乳酸菌生長(zhǎng)活 性，以 pH 值 3.8之 PDA 雖然可降低大部分 乳酸菌活性，但還是有耐酸特性較強(qiáng)的乳酸 菌無法被抑制，故以 pH 3.8之酸化 PDA 不 足以客觀表現(xiàn)乳酸活菌產(chǎn)品之衛(wèi)生檢測(cè)結(jié)果。
根據(jù)表4 結(jié)果顯示，由各種酸液調(diào)整pH 之PDA對(duì)於L. plantarum生長(zhǎng)活性無顯著差 異，為了改進(jìn)此缺點(diǎn)，後續(xù)實(shí)驗(yàn)使用實(shí)驗(yàn)室 內(nèi)最常見之酸液（鹽酸）製備酸化PDA，再 由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果改良實(shí)驗(yàn)方法，以10% 鹽酸 酸液調(diào)整 PDA 之 pH，由原始 pH5.1調(diào)整至 pH 3.5、3.0、2.5。各乳酸菌接種至 MRS Broth 37℃培養(yǎng)16~18小時(shí)，再以MRS agar 傾注培養(yǎng)37℃2-3天，同時(shí)以不同pH之PDA 傾注培養(yǎng)25℃5-7天，培養(yǎng)後觀察結(jié)果如表 5。將活性乳酸菌傾注培養(yǎng)於 pH 3.5、3.0、 2.5之 PDA 中，各乳酸菌皆無法生長(zhǎng)，證明 降低pH值可以抑制乳酸菌活性。 為了確認(rèn)真菌生長(zhǎng)活性不受高酸性環(huán)境 影響，本研究將黴菌與酵母菌以傾注法培養(yǎng) 於不同 pH 之 PDA 平板，再以25℃培養(yǎng)5-7 天，觀察其生長(zhǎng)情形，結(jié)果如圖1、圖2 所 示，代表黴菌的Aspergillus oryzae與代表酵 母菌的 Saccharomyces cerevisiae 皆可於低 pH之PDA平板生長(zhǎng)，由此可知低pH 之PDA 黴菌與酵母菌亦可生長(zhǎng)，觀察酸化PDA平板 生長(zhǎng)之菌落型態(tài)與未調(diào)整pH之 PDA並無差 異，生長(zhǎng)活性亦無明顯差別，將PDA酸化可 大幅降低乳酸菌在PDA中檢出機(jī)率，且不影 響黴菌與酵母菌檢測(cè)，進(jìn)而降低檢測(cè)報(bào)告之 偽陽性。
討論
依據(jù)本研究結(jié)果乳酸菌於PDA上生長(zhǎng)活 性測(cè)試結(jié)果證明乳酸活菌可被PDA檢出來。 若以無經(jīng)處理之PDA檢測(cè)含活性乳酸菌之產(chǎn) 品，檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有偽陽性，進(jìn)而影響品 管檢驗(yàn)判定。為使品管檢驗(yàn)更加準(zhǔn)確，必須 開發(fā)抑制乳酸菌於PDA之生長(zhǎng)活性方法。本 研究以一般酸化PDA (pH 3.8)確實(shí)可抑制乳 酸菌生長(zhǎng)活性，但有部分乳酸菌耐酸度較強(qiáng)， pH 3.8亦可生長(zhǎng)。由此可知酸化是一個(gè)有效 且可行的方法，但需再作改善，經(jīng)由再降低 pH至 3.5-2.5的PDA確實(shí)能有效抑制乳酸菌 活性，且不影響黴菌與酵母菌生長(zhǎng)活性，因 此，將PDA酸化至pH 3.5-2.5範(fàn)圍內(nèi)後再檢 驗(yàn)含乳酸活菌產(chǎn)品，可以使衛(wèi)生檢驗(yàn)結(jié)果降
低其偽陽性而更加準(zhǔn)確。本研究使用一株酵 母及一株黴菌做為測(cè)試基準(zhǔn)，未來將進(jìn)一步 測(cè)試多種真菌於酸化PDA生長(zhǎng)情形，以確認(rèn) 酸化PDA檢驗(yàn)適用性。
參考文獻(xiàn)
1. 食品工業(yè)發(fā)展研究所。2018 食品產(chǎn)業(yè)年鑑。 2018.08.08。食品工業(yè)發(fā)展研究所。臺(tái)灣。 2. 林志勳。有機(jī)酸和乳酸菌之相互關(guān)係。現(xiàn)代養(yǎng)豬。 2011; 32:18-20。臺(tái)灣動(dòng)物科技研究所， 臺(tái)灣。 3. 王鳳梅，馬利兵。內(nèi)蒙古西部地區(qū)本土葡萄酒釀酒 酵母發(fā)酵特性研究。2015; 31:204-8，生物技術(shù)通報(bào)。 中國(guó)。 4. 衛(wèi)生福利部食品藥物管理署。食品微生物之檢驗(yàn)方 法－黴菌及酵母菌數(shù)之檢驗(yàn)。2013。2013.09.06部授 食字第 1021950329 號(hào)公告修正。行政院衛(wèi)生福利 部，臺(tái)灣。
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